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ruililian09銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
我的蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量低怎么辦？
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我的目的基因約1000bp，用PET-28a載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中表達(dá)。第一次在37℃表達(dá)，用0.1~1mMIPTG誘導(dǎo)結(jié)果還不錯，蛋白基本都在上清中，但表達(dá)量也不是很高（見附件中的圖）。但是后來又做了幾次表達(dá)，一樣的條件但就是做不出原來的表達(dá)量了，不知道是為什么，請各位幫幫忙。我現(xiàn)在在重新提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，不知道有沒有用。要是不行的話，是不是要考慮換載體或者宿主菌什么的？ 2012-12-26 37℃誘導(dǎo)5小時.scn(2.77MB) http://kuai.xunlei.com/d/LnU4DXbXYx-pUAQA57b?p=130497 |
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linxt2005
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ruililian09: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-01-08 12:32:59
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ruililian09: 金幣+3, ★★★★★最佳答案 2013-01-08 12:32:59
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我覺得感受態(tài)的好壞只是影響轉(zhuǎn)化效率，對表達(dá)的影響應(yīng)該比較小。 樓主可以從表達(dá)條件方面來優(yōu)化， 1.延長誘導(dǎo)時間，選擇合適的IPTG用量； 2.選用合適的溫度，比如樓上說的降低溫度 3.更換感受態(tài)，比如樓上說的用含 pLys S 質(zhì)粒的。 4.更換培養(yǎng)基，比如TP往往比LB要好些。 從樓主的遇到的情況來看，應(yīng)該是表達(dá)的目的蛋白對宿主菌影響比較大，或者說有毒性， 所以質(zhì)粒在傳代時丟失了，而通過重提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化可以解決。 那么可以通過使用待毒性的宿主菌感受態(tài)比如C41等， 或者嚴(yán)格控制表達(dá)，比如使用含pLys S質(zhì)粒的宿主菌，或者誘導(dǎo)前添加適量的葡萄糖， 應(yīng)該會有效果。 另外，目的蛋白融合標(biāo)簽的方法也能促進(jìn)表達(dá)，但是在這種情況下，往往是因為其影響了目的蛋白的活性， 這個對后期可能會比較麻煩。 |
7樓2013-01-08 10:52:52
pennchem
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ruililian09
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4樓2013-01-07 21:41:42
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