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ym6104金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
長(zhǎng)片段的連接轉(zhuǎn)化問(wèn)題，望大俠們賜教！
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| 新手一枚，現(xiàn)在在擴(kuò)兩個(gè)3000bp左右的基因，做TA克隆，PCR的條帶很亮，膠回收后跑瓊脂糖檢測(cè)條帶也挺亮，用的是TAKARA 的LA TAQ，之后用TAKARA的PMD-19連接過(guò)夜，再用全式金的T1感受態(tài)轉(zhuǎn)化，涂板之后也長(zhǎng)菌了，但沒(méi)有之前擴(kuò)短片段的時(shí)候多，做菌落PCR檢測(cè)卻什么條帶也沒(méi)有�，F(xiàn)在覺(jué)得是片段太長(zhǎng)沒(méi)有連接上，所以想請(qǐng)教一下各位，有什么改進(jìn)的辦法嗎？還是說(shuō)得分段擴(kuò)增，那分段的話(huà)在分的片段的太小和引物設(shè)計(jì)上有什么要求嗎？ |
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draco1987
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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13樓2013-01-11 11:23:22
2樓2013-01-10 20:50:18
ccharlien
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ym6104: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-01-11 09:33:37
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
ym6104: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-01-11 09:33:37
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你做菌落PCR用的什么引物��？如果是和克隆一樣的引物是有可能擴(kuò)不出來(lái)的，從質(zhì)粒上擴(kuò)出3000和從菌液中擴(kuò)出3000還是會(huì)有點(diǎn)差別的 一般做菌落PCR一端用載體上的通用引物一端用片段上的引物，片段小一些保證效率 比如一個(gè)T7正向+基因5‘端的反向引物 基因3‘端的正向引物+BGH反向引物 這樣把方向確定好 選對(duì)的測(cè)序 |
3樓2013-01-10 21:05:10
ym6104
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4樓2013-01-10 21:10:24
ym6104
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5樓2013-01-10 21:12:49
ccharlien
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6樓2013-01-10 22:14:43
kangqx2212
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7樓2013-01-10 22:26:13
ym6104
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8樓2013-01-10 23:00:17
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9樓2013-01-10 23:00:25
ym6104
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10樓2013-01-10 23:02:18
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