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wl554520877鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
求高人指點(diǎn)qpcr問題，擴(kuò)增效率太高！
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最近做熒光定量，問題重重，先是跑了個內(nèi)參試試，做個標(biāo)曲，結(jié)果出來了，擴(kuò)增效率很高，達(dá)到200%，不過溶解曲線卻是單一峰；還有就是ntc也有值，搞不明白，跑了個膠發(fā)現(xiàn)有條帶應(yīng)該是引物二聚體吧，我新手也不確定。上圖吧，求分析，求幫助！ 4.jpg 2.jpg |
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2013-01-14 21:04:51, 131.92 K
2013-01-14 21:04:53, 122.64 K
2013-01-14 21:04:53, 15.23 K
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cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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擴(kuò)增效率高一般是說明有非特異性擴(kuò)增或者有引物二聚體。 如果有引物二聚體，熔解曲線上會有比產(chǎn)物溫度低的峰出現(xiàn)。一般的正常產(chǎn)物熔解溫度高于80°C，引物二聚體的熔解溫度會比較低，一般是七十多度。雖然你說熔解曲線是單一的峰，但在我看來，在70-80°C之間有兩個不明顯的小峰，從左邊的圖也能看出有三處slop的變化。溫度低的小峰在負(fù)對照中明顯放大。只有高于84°C的那個是正常產(chǎn)物。這個圖已經(jīng)很明顯的表示擴(kuò)增不特異。從跑的膠的圖上看，似乎有引物二聚體和單體，也可能是非特異產(chǎn)物。你的PCR體系中引物的濃度用的是多少？是不是太高了。此外，你是否對引物做了溫度梯度確定最佳退火溫度。 你的負(fù)對照擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線明顯只有溫度低的峰，沒有目標(biāo)峰，如果已經(jīng)用了最佳退火溫度，這說明引物設(shè)計(jì)有問題。 |
wl5545208775樓2013-01-15 08:59:51
wl554520877
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2樓2013-01-14 21:08:04
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，問題還沒解決。覺得是引物問題。 3樓2013-01-14 22:23:03
wl554520877
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4樓2013-01-15 08:38:18
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