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mjzjily銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
DpnI 酶消化不了模板，求解。
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| 我最近用PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增線性化質(zhì)粒，擴(kuò)增之后用DpnI消化模板。但是構(gòu)建后依然有很多的假陽性，說明DpnI酶沒有起作用。我的質(zhì)粒是用DH5α擴(kuò)增的。之前也試過將質(zhì)粒線性化后再PCR，但多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不可行。主要問題就是為什么DpnI酶沒有起作用？另外，我現(xiàn)在也計劃先將質(zhì)粒甲基化酶處理再做PCR后，在用DpnI酶消化，不知道哪些甲基化酶比較好？謝謝各位！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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DpnI酶的堿基識別序列要甲基化才能被切開，PCR產(chǎn)物沒有被甲基化吧？ 不知道你的DpnI位點(diǎn)在產(chǎn)物的什么部分，如果你設(shè)計引物時加入的酶切位點(diǎn)，那么就有一個末端酶切效率（酶切位點(diǎn)在末端是，很多酶的酶切效率會很低）的問題，建議在引物設(shè)計時除了加入酶切位點(diǎn)外，末端再加入兩個左右的堿基，以提高酶切效率。 |
2樓2013-01-23 16:18:26
greenygreen
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3樓2013-01-23 20:12:20
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5樓2013-01-24 07:54:06
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因?yàn)樗玫腄pnI酶是新訂的，沒考慮這個酶失效的問題。感謝你的提醒，我試一下。 7樓2013-01-25 14:13:18
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8樓2013-01-25 14:15:12
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10樓2013-01-26 19:09:55
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