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mjzjily銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
DpnI 酶消化不了模板，求解。
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| 我最近用PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增線性化質(zhì)粒，擴(kuò)增之后用DpnI消化模板。但是構(gòu)建后依然有很多的假陽性，說明DpnI酶沒有起作用。我的質(zhì)粒是用DH5α擴(kuò)增的。之前也試過將質(zhì)粒線性化后再PCR，但多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不可行。主要問題就是為什么DpnI酶沒有起作用？另外，我現(xiàn)在也計(jì)劃先將質(zhì)粒甲基化酶處理再做PCR后，在用DpnI酶消化，不知道哪些甲基化酶比較好？謝謝各位！ |
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0405lanfeng
新蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mjzjily: 金幣+3 2013-01-25 14:17:52
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mjzjily: 金幣+3 2013-01-25 14:17:52
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我前幾天做定點(diǎn)突變 用的NEB的 Dpn1，效果還不錯(cuò)。你說的先消化后擴(kuò)增，我覺得不行，這樣很可能把你要的片段都給切斷的。還有，消化的時(shí)間可以延長，protocol 說一兩個(gè)小時(shí)就夠了 不過我至少五個(gè)小時(shí) 還有次是過夜的。各人認(rèn)為消化久了好~ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
5樓2013-01-24 07:54:06
yesali
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問題。 2013-01-23 18:55:48
mjzjily: 金幣+1 2013-01-25 14:17:07
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mjzjily: 金幣+1 2013-01-25 14:17:07
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DpnI酶的堿基識(shí)別序列要甲基化才能被切開，PCR產(chǎn)物沒有被甲基化吧？ 不知道你的DpnI位點(diǎn)在產(chǎn)物的什么部分，如果你設(shè)計(jì)引物時(shí)加入的酶切位點(diǎn)，那么就有一個(gè)末端酶切效率（酶切位點(diǎn)在末端是，很多酶的酶切效率會(huì)很低）的問題，建議在引物設(shè)計(jì)時(shí)除了加入酶切位點(diǎn)外，末端再加入兩個(gè)左右的堿基，以提高酶切效率。 |
2樓2013-01-23 16:18:26
greenygreen
銀蟲 (小有名氣)
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3樓2013-01-23 20:12:20
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4樓2013-01-23 21:54:40
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