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mjzjily銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
DpnI 酶消化不了模板，求解。
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| 我最近用PCR擴(kuò)增的方法擴(kuò)增線性化質(zhì)粒，擴(kuò)增之后用DpnI消化模板。但是構(gòu)建后依然有很多的假陽(yáng)性，說(shuō)明DpnI酶沒(méi)有起作用。我的質(zhì)粒是用DH5α擴(kuò)增的。之前也試過(guò)將質(zhì)粒線性化后再PCR，但多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不可行。主要問(wèn)題就是為什么DpnI酶沒(méi)有起作用？另外，我現(xiàn)在也計(jì)劃先將質(zhì)粒甲基化酶處理再做PCR后，在用DpnI酶消化，不知道哪些甲基化酶比較好？謝謝各位！ |
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greenygreen
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【答案】應(yīng)助回帖
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mjzjily: 金幣+2 2013-01-25 14:17:18
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mjzjily: 金幣+2 2013-01-25 14:17:18
| 你所說(shuō)的消化模版，是指要消化PCR反應(yīng)中加入的質(zhì)粒DNA模版么？那應(yīng)該完全沒(méi)有問(wèn)題。因?yàn)镈H5a菌株提出的質(zhì)粒本身就是帶有甲基化位點(diǎn)的，完全可以被消化。這也是基于PCR-DpnI消化法制備突變質(zhì)粒的原理。而且假陽(yáng)性不代表完全沒(méi)有被消化，這與模版的量以及酶的活性有關(guān)。應(yīng)多挑些驗(yàn)證或者確認(rèn)酶的活性。 |
3樓2013-01-23 20:12:20
yesali
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【答案】應(yīng)助回帖
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DpnI酶的堿基識(shí)別序列要甲基化才能被切開(kāi)，PCR產(chǎn)物沒(méi)有被甲基化吧？ 不知道你的DpnI位點(diǎn)在產(chǎn)物的什么部分，如果你設(shè)計(jì)引物時(shí)加入的酶切位點(diǎn)，那么就有一個(gè)末端酶切效率（酶切位點(diǎn)在末端是，很多酶的酶切效率會(huì)很低）的問(wèn)題，建議在引物設(shè)計(jì)時(shí)除了加入酶切位點(diǎn)外，末端再加入兩個(gè)左右的堿基，以提高酶切效率。 |
2樓2013-01-23 16:18:26
Haibara_Ai
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4樓2013-01-23 21:54:40
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【答案】應(yīng)助回帖
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mjzjily: 金幣+3 2013-01-25 14:17:52
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我前幾天做定點(diǎn)突變 用的NEB的 Dpn1，效果還不錯(cuò)。你說(shuō)的先消化后擴(kuò)增，我覺(jué)得不行，這樣很可能把你要的片段都給切斷的。還有，消化的時(shí)間可以延長(zhǎng)，protocol 說(shuō)一兩個(gè)小時(shí)就夠了 不過(guò)我至少五個(gè)小時(shí) 還有次是過(guò)夜的。各人認(rèn)為消化久了好~ [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
5樓2013-01-24 07:54:06
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