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[求助] 求助關(guān)于融合蛋白的linker連接問(wèn)題已有1人參與

各位蟲(chóng)友，大家好！我準(zhǔn)備做融合蛋白表達(dá)，已經(jīng)擬定好了linker的序列。但是不知道怎么把linker和連個(gè)目的片段連接起來(lái)。謝謝大俠指導(dǎo)

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1樓 2013-01-23 20:26:29

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gyesang

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【答案】應(yīng)助回帖

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第一種方法，有限制酶切連接的方法，先把linker設(shè)計(jì)在A基因的引物上，然后先構(gòu)建在載體上，然后再把B基因插在linker的后面
第二種方法，做Overlap PCR，先獲得A+linker+B的全長(zhǎng)序列，然后再構(gòu)建到載體上

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2樓2013-01-24 10:21:54

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

PrimerF primerR‘ linker（45bp） primerF’ PrimerR
primerR‘ primerF’ 和 linker 重疊,PCR連起來(lái)就行了
合成6段引物 linker部分直接合出來(lái)（你愿意合成超過(guò)60bp的大引物直接連起來(lái)也行，主要單獨(dú)合一次linker以后還可以再用）

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6樓2013-01-24 11:48:45

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gastrodia

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

如果linker不是很長(zhǎng)，在引物合成的時(shí)候直接合成進(jìn)去

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3樓2013-01-24 10:34:09

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引用回帖:

3樓: Originally posted by gastrodia at 2013-01-24 10:34:09
如果linker不是很長(zhǎng)，在引物合成的時(shí)候直接合成進(jìn)去

我準(zhǔn)備用15個(gè)氨基酸作為linker，不知道需不需要單獨(dú)合成linker。直接PCR能擴(kuò)進(jìn)去嗎？如果直接擴(kuò)，是不是linker中間加酶切位點(diǎn)，分別在兩個(gè)預(yù)聯(lián)合的片段的引物可加一部分linker序列？謝謝

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4樓2013-01-24 11:36:08

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2樓: Originally posted by gyesang at 2013-01-24 10:21:54
第一種方法，有限制酶切連接的方法，先把linker設(shè)計(jì)在A基因的引物上，然后先構(gòu)建在載體上，然后再把B基因插在linker的后面
第二種方法，做Overlap PCR，先獲得A+linker+B的全長(zhǎng)序列，然后再構(gòu)建到載體上

謝謝

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5樓2013-01-24 11:37:30

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請(qǐng)問(wèn)，你的Linker是什么啊，能否分享下啊，我也在做這個(gè)呢，發(fā)現(xiàn)不太好設(shè)計(jì)啊�。�！

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7樓2013-02-21 11:05:29

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非常想問(wèn)一下，如果選用Fc標(biāo)簽構(gòu)建融合蛋白，那么分泌的融合蛋白都是以二聚體形式嗎？會(huì)不會(huì)影響功能？linker長(zhǎng)度？

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沒(méi)有人生來(lái)灑脫，都總是在哭過(guò)以后才會(huì)感到輕松許多。

8樓2014-09-18 10:01:26

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weiyuanzheng

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6樓: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-01-24 11:48:45
PrimerF primerR‘ linker（45bp） primerF’ PrimerR
primerR‘ primerF’ 和 linker 重疊,PCR連起來(lái)就行了
合成6段引物 linker部分直接合出來(lái)（你愿意合成超過(guò)60bp的大引物直接連起來(lái)也行，主要單獨(dú)合 ...

非常想問(wèn)一下，如果選用Fc標(biāo)簽構(gòu)建融合蛋白，那么分泌的融合蛋白都是以二聚體形式嗎？會(huì)不會(huì)影響功能？linker長(zhǎng)度？

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9樓2014-09-18 10:02:02

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【答案】應(yīng)助回帖

我的linker也是15個(gè)氨基酸，通過(guò)overlap將兩個(gè)蛋白連接起來(lái)，但是多次overlap結(jié)果都是中間搭橋部分少4個(gè)氨基酸，我想知道少這四個(gè)氨基酸，會(huì)不會(huì)對(duì)酶有影響

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走著走著，花就開(kāi)了

10樓2015-08-24 11:12:28

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