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gaoyu_1984金蟲 (小有名氣)
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[求助]
rt-qpcr標(biāo)準(zhǔn)曲線問題
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大家好，最近在做rt-qpcr，用了很久的標(biāo)曲RNA樣品(最高濃度約為90ng/uL，稀釋5個(gè)梯度)，兩周之前一切正常，慢慢就開始最低那個(gè)濃度梯度不能擴(kuò)增，后來迅速發(fā)展為倒數(shù)第二個(gè)也不能擴(kuò)增。標(biāo)曲只剩下了3個(gè)點(diǎn)。以為是RNA降解了，于是重新制作了標(biāo)樣，濃度約為300ng/uL，可最低兩個(gè)濃度還是不能正確有效擴(kuò)增，前面三個(gè)濃度CT分別約為（18.75，20.74, 24.54） 于是又考慮probe,primer，RNase free water污染等原因，重新取了primer和probe stock（開封半年，-30度保存），還是一樣。然后又用了新kit，全部使用了帶濾膜的槍頭，可還是一樣。 kit: platimum quantitative rt-pcr thermoscript one-step system (invitrogen) 還請(qǐng)明白人指點(diǎn)一下那里可能出了問題。 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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gaoyu_1984
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4樓2013-01-29 08:22:48
wqj1988926
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
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amisking: 金幣+2, 鼓勵(lì)積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-01-28 19:58:10
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我個(gè)人不太理解樓主的實(shí)驗(yàn)，我說下我個(gè)人做這方面實(shí)驗(yàn)的過程，希望有參考價(jià)值。 1. 采用絕對(duì)定量的方法的時(shí)候，做標(biāo)曲所采用的是標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，10倍濃度稀釋 2. 相對(duì)定量的時(shí)候做標(biāo)曲所采用的標(biāo)準(zhǔn)品是反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA，也是同樣稀釋。 樓主所采用的RNA來做標(biāo)曲，理論上也是可以的，但操作不好的話可能真的會(huì)講解。 |
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gaoyu_1984
2樓2013-01-28 16:40:23
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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rna濃度越低越容易降解，這是一方面 另一方面認(rèn)真回憶回憶你的實(shí)驗(yàn)操作步驟，和第一次成功的那次比對(duì)下 |
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3樓2013-01-28 17:33:58
gaoyu_1984
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5樓2013-01-29 08:27:35
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