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包子飛揚銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
微生物長期保存方法 已有1人參與
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| 求助各位大蝦，微生物除了冷凍保存外，還有什么其他長期保存的方法，簡單便于操作的，多謝多謝！ |
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zhangxingc
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包子飛揚(金幣+1): 謝謝參與
amisking: 金幣+2, 鼓勵積極發(fā)帖幫助解答問題。 2013-02-16 20:39:06
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9.3 菌種保藏的原理和方法 采用優(yōu)良的純種，最好是休眠體（分生孢子、芽孢等），創(chuàng)造一個使微生物代謝不活潑，生長繁殖受抑制，難以突變的環(huán)境條件，其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營以及添加保護(hù)劑等。 9.3.1 定期移植保藏法 斜面、液體培養(yǎng)基、穿刺等培養(yǎng)成健壯菌體（對數(shù)期細(xì)胞等）后，將菌種置4℃冰箱保藏，每隔一定時間重新移植培養(yǎng)一次。 表格 15 各種菌定期移植保藏法保藏時間 類型 間隔時間 備注 芽孢桿菌 3-6個月 其它細(xì)菌每月一次 放線菌 3個月 4-6℃保藏 酵母菌 4-6個月 4-6℃保藏 類酵母類 1-2個月 牙裂酵母、阿氏假囊酵母、棉病囊霉等 絲狀真菌 4個月 4-6℃ 擔(dān)子菌 3個月 4-6℃ 9.3.2 液體石蠟保藏法 該方法是定期移植保藏法的補充，在生長良好的斜面表面覆蓋一層無菌的液體石蠟，液面高出培養(yǎng)基1cm，將其置試管架上以直立狀態(tài)低溫保藏。液體石蠟可以防止水分蒸發(fā)、隔絕氧氣，所以能延長保藏的時間。但其缺點是必須直立放在冰箱內(nèi)，占據(jù)較大的空間。 圖表 3 液體石蠟保藏法示意圖 9.3.3 沙管保藏法、土壤保藏法 統(tǒng)稱為沙土管法。 沙管保藏法：取河沙過24目篩，用10%-20%的鹽酸浸泡除去有機質(zhì)，洗滌，烘干，分裝入安瓿管，加塞滅菌。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，再用無菌水制成細(xì)胞或孢子懸液，將10滴懸液注入裝有洗凈、滅菌河沙的沙管內(nèi)，使細(xì)胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，將干燥器的沙管用火焰熔封管口，可以室溫或低溫保藏。 土壤保藏法：以土壤代替河沙，不需酸洗，經(jīng)風(fēng)干、粉碎、過24目篩，分裝滅菌后，同上制備。 二者的特點是干燥、低溫、隔氧、無營養(yǎng)物。保藏效果較好，制作簡單，比液體石蠟法保藏時間長。此法適用于芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、放線菌和一些絲狀真菌的保藏。保藏時間可達(dá)數(shù)年，甚至數(shù)十年。 圖表 4 沙土管保藏示意圖 9.3.4 麩皮保藏法 也稱曲法保藏，常用于放線菌和霉菌的保藏。將麩皮（也可用谷各種谷物代替）與水或其他培養(yǎng)基成分以一定的比例拌勻。加水或培養(yǎng)液與麩皮的比例為1:0.8或1:1或1:1.5，原則是按照不同菌種對水分要求不同。將拌勻的麩皮分裝在試管或安瓿管等容器中，裝入的麩皮應(yīng)保持疏松，不要緊壓。高溫滅菌后，將菌種的孢子液接入，適宜溫度下培養(yǎng)，直至長出菌絲，再放干燥器中干燥后，20℃以下溫度保藏。也可將小管用火焰熔封。 該法操作簡單，菌種保藏時間長，不易退化，工廠中經(jīng)常采用。 9.3.5 蒸餾水保藏法 最簡單的保藏方法。每個試管中裝5mL滅菌的無菌水，用接種針從斜面或平板上挑取一環(huán)菌種細(xì)胞，接入蒸餾水中并使之懸浮。試管用無菌的橡皮塞塞緊，放置10℃低溫保藏。使用時，可從管內(nèi)移出一環(huán)接到培養(yǎng)基上，而原來的管加塞后仍可繼續(xù)保藏。該法為菌種創(chuàng)造了一個無營養(yǎng)的環(huán)境，所以也是一種保藏菌種的好方法。 根據(jù)De Vay試驗，該法適宜保藏詭譎棒狀桿菌（Cornebacterium insidiosum）、根瘤病土壤桿菌（Agrobacterium lumefaciens）、假單胞菌（Pseudomous sp.）等，也有人將其用于酵母菌保藏。 9.3.6 冷凍干燥保藏法 將菌液在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中水分，最后獲得干燥的菌體樣品。同時具備干燥、低溫和缺氧的菌種保藏條件，所以可使微生物得到較長時間的保存。 除不生孢子只產(chǎn)菌絲體的絲狀真菌不宜用此法外，其他多數(shù)微生物，如病毒、細(xì)菌、放線菌等都能凍干保藏。許多菌種用此法可保藏10年以上。具體做法，書中有詳細(xì)記載[26]。 圖表 5 冷凍干燥保藏菌種的一般流程 預(yù)凍：菌懸液不能有過多的氣泡，分裝安瓿管后為避免保護(hù)劑可能帶入的培養(yǎng)基中某些成分或產(chǎn)物的影響，在1h內(nèi)必須將分裝安瓿管放到-30℃以下的超低溫冰箱或凍干裝置中預(yù)凍0.5-1h，然后在真空度0.5mmHg（約66.66Pa）下進(jìn)行抽干，并逐漸達(dá)到0.1-0.2mmHg（約13.33-26.66Pa）。在真空度達(dá)到0.2mmHg時水分大量升華，也可以略加溫以加快樣品中水分升華。當(dāng)真空度達(dá)到0.01mmHg時，一邊抽氣一邊可用噴燈熔封安瓿管口，然后以高頻電火花檢查各安瓿的真空情況。管內(nèi)呈灰藍(lán)色光表示已達(dá)到真空。檢查時電火花應(yīng)射向安瓿的上半部，切勿直射樣品。制成的安瓿管可在4℃冰箱或室溫下保藏，且盡量避光保藏。 有些菌種不適宜用冷凍干燥保藏法。安瓿管尺寸見文獻(xiàn)[27]。 9.3.7 液氮超低溫保藏法 鑒于有些微生物不家采用冷凍干燥法，可以采取此法長期保藏，但少量對低溫?fù)p傷敏感的微生物除外液氮保藏法的最大優(yōu)點是可利用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，不論孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可使用該法。 液氮溫度-150℃至-196℃。 關(guān)于冷凍結(jié)晶的形成過程，請參閱文獻(xiàn)[26]。液氮若不幸進(jìn)入管內(nèi)，則有很強的爆炸力。 9.3.8 甘油保藏法 此法與液氮超低溫保藏法相似。菌種懸浮在10%（體積分?jǐn)?shù)）甘油蒸餾水，置低溫（-80℃－-70℃）保藏。該法較簡便，保藏期較長，但需要有超低溫冰箱。實際工作中，常將待保藏菌培養(yǎng)至對數(shù)期的培養(yǎng)液直接加到已滅過菌的甘油中，并使甘油的終濃度在10%-30%左右，再分裝于小離心管中，置低溫保藏�；蚬こ叹２捎迷摲ū２�。 |
3樓2013-02-16 11:17:06
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