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凡凡高高高金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
克隆擬南芥的基因，為什么每次測(cè)序結(jié)果出來(lái)都是比TAIR網(wǎng)站上標(biāo)注的序列多出20個(gè)堿基呢
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| 最近在做載體構(gòu)建，但是在克隆上就出現(xiàn)了問(wèn)題，使得實(shí)驗(yàn)難有進(jìn)展，以cDNA做模板，為什么每次克隆出來(lái)的得基因序列都比TAIR網(wǎng)站上標(biāo)注的序列多出20個(gè)堿基呢？是網(wǎng)站上的信息錯(cuò)誤還是操作的原因？又該怎么應(yīng)對(duì)這種情況呢？求大神指點(diǎn) |
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stone2239
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凡凡高高高
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zgb1982
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8樓2013-08-23 18:50:59
atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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嗯............... 問(wèn)下樓主的cDNA合成時(shí)用的OligodT還是OligodT和Random Hexamers混合方式？我以前采用后一種cDNA合成方式，擴(kuò)一個(gè)較長(zhǎng)的基因（大概3.5Kb）時(shí)就出現(xiàn)了融合有4bp的內(nèi)含子序列（其他均正確），當(dāng)初分析的就是沒(méi)有用DNaseI處理RNA，導(dǎo)致gDNA微量存在，使擴(kuò)增過(guò)程出現(xiàn)錯(cuò)誤。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過(guò)程嫌DNaseI處理會(huì)損失RNA我就沒(méi)有做，其實(shí)這點(diǎn)很必要的。Random Hexamer是無(wú)節(jié)操性結(jié)合的引物，所以產(chǎn)生這種融合現(xiàn)象并不奇怪。 樓上各位說(shuō)的variant也是可能的。TAIR并不是唯一。 所以嘛，和PCR有關(guān)的實(shí)驗(yàn)怪異現(xiàn)象，非常之多，因?yàn)镻CR本身就是一個(gè)神奇的技術(shù)~（笑） 個(gè)人看法，若有說(shuō)錯(cuò)請(qǐng)高手指點(diǎn) |
9樓2013-08-23 19:44:45
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