 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 8770 | 回復(fù): 6 | ||
追風(fēng)舞塵鐵蟲 (初入文壇)
|
[求助]
測序結(jié)果出現(xiàn)單堿基的重疊峰 已有1人參與
|
|
大家好啊！ 我先設(shè)計了一對引物，分別對雌雄進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，測序的結(jié)果序列都是一樣的，但是有個小問題，為什么其中一個堿基出現(xiàn)了重疊峰，其它堿基都沒有，不知道什么原因，又代表著什么意思？我這兩個序列都是克隆測序的，之前在另外一個擴(kuò)增中也得出了相同的重疊峰 希望了解的高手們能給出答案��！ 實驗好急···  H4X，H4C比對.jpg |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有129人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 測序結(jié)果丟了個堿基
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 克隆擬南芥的基因，為什么每次測序結(jié)果出來都是比TAIR網(wǎng)站上標(biāo)注的序列多出20個堿基呢
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 測序出現(xiàn)重疊現(xiàn)象怎么處理
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 請問在測序反應(yīng)中某個堿基出現(xiàn)套峰，是否說明該等位基因是雜合子呢？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 兩次測序結(jié)果差幾個堿基可以嗎？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助】急~~測序發(fā)現(xiàn)在引物位置發(fā)現(xiàn)一個堿基缺失
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在引物位置多了一位堿基，是什么原因引起的？
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 我的測序結(jié)果顯示多出一個堿基來 整個編碼序列的堿基數(shù)就不是3的倍數(shù)了
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 測序結(jié)果顯示多了一個堿基，峰圖上正常，請問什么原因？謝謝
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 測序后的DNA序列與預(yù)測的有幾個堿基不同，怎么辦
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 【求助/交流】測序時，為什么測序結(jié)果是與目的堿基序列 反向互補(bǔ)的序列呢？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】測序后發(fā)現(xiàn)pcr產(chǎn)物中堿基錯配。原因？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】測序出現(xiàn)重疊峰是怎么回事？
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】為什么測序之后各個菌落之間總會有堿基的差異？
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 測序關(guān)于堿基的確定
已經(jīng)有7人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+5, 鼓勵發(fā)帖解答問題。 2013-06-13 18:43:36
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
amisking: 金幣+5, 鼓勵發(fā)帖解答問題。 2013-06-13 18:43:36
|
有這樣一種情況 當(dāng)某一個基因來源于父本和母本，即這個基因在基因組中有2個拷貝，而兩個拷貝之間有單堿基的不同，而你PCR時同時克隆出了兩個拷貝，那么測序的時候就有可能是你測序的那種結(jié)果。 你可以看一下那個堿基的突變是否影響氨基酸。 你可以將你測序的結(jié)果和NCBI上的結(jié)果比對一下，看一下那個位置是否有SNP。如果有那就是正常的了，如果沒有，建議重復(fù)一次，或者克隆到載體中，多挑幾個克隆測序 |
2樓2013-06-13 17:16:27
追風(fēng)舞塵
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 111.5
- 帖子: 21
- 在線: 15.2小時
- 蟲號: 1868888
- 注冊: 2012-06-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
3樓2013-06-13 21:54:51
wu_shiyong
銀蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 34 (小學(xué)生)
- 金幣: 428.3
- 散金: 100
- 紅花: 1
- 帖子: 526
- 在線: 173.1小時
- 蟲號: 1852532
- 注冊: 2012-06-08
- 性別: GG
- 專業(yè): 植物資源學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-15 21:36:47
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵交流 2013-06-15 21:36:47
| 你測序如果是單克隆測序應(yīng)該不會出現(xiàn)這樣的情況，測序也需要擴(kuò)增，也許引入了突變。但是你以前的測序也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果，我想可能就是你的單克隆并非單克隆，從峰圖上看這是很明顯的雜合體，測序結(jié)果底峰有點(diǎn)高！建議多挑幾個單克隆測序，并用你的PCR產(chǎn)物同時做雙向測序！預(yù)計結(jié)果是PCR產(chǎn)物有同樣的套峰，而克隆沒有套峰且這個點(diǎn)的堿基有兩種！ |
4樓2013-06-14 09:06:03
追風(fēng)舞塵
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 111.5
- 帖子: 21
- 在線: 15.2小時
- 蟲號: 1868888
- 注冊: 2012-06-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2013-06-14 14:38:39
BiologyDYJLU
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 0.9
- 帖子: 60
- 在線: 7.6小時
- 蟲號: 1717731
- 注冊: 2012-03-26
- 專業(yè): 分子與進(jìn)化生態(tài)學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
|
請問在測序反應(yīng)中某個堿基出現(xiàn)套峰，是否說明該等位基因是雜合子呢？ 初始懸賞金幣 10 個 請問在測序反應(yīng)中某個堿基出現(xiàn)套峰，是否說明該等位基因是雜合子呢？ 套峰？我只知道那代表測序沒測好吧。你測了幾次？每次都一樣嗎。什么是雜合子。你拿什么去測的 在特定一個堿基上，測了三次，每次都有套峰。雜合子就是說等位基因在這個堿基的位置上是存在SNP的，所以會產(chǎn)生套峰。是不是這樣呢？ 如果只在某個堿基處有套峰，其他地方都沒有雜峰，那基本上就是雜合的。用反向引物再測一次，結(jié)果更準(zhǔn)確。 那請問你是送的啥去測序？ 常用的方法1：pcr產(chǎn)物純化->回收連質(zhì)粒->轉(zhuǎn)化搖菌->平板挑單克隆->單克隆培養(yǎng)并PCR驗證->送菌液； 方法2：PCR產(chǎn)物純化->回收測濃度->送測序。 方法1的話，即便是雜合子也測不出來套峰……方法2的話，倒是有可能出套峰。 這個位置前后都一致么？是否雙向測序呢？位置附近的峰圖正常好看不？最好貼一下。 測序出現(xiàn)重疊峰是怎么回事？ 我是用PCR產(chǎn)物直接測序的，電泳圖上條帶很清楚也沒有拖尾巴，會出現(xiàn)雜帶嗎？還有我的產(chǎn)物里是含染料的會有影響嗎？ 周_yan (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我認(rèn)為應(yīng)該不是你說的這方面原因，而是測序時的問題，測序一個反應(yīng)只能準(zhǔn)確測700bp左右，超過這些就會測不準(zhǔn)，出現(xiàn)重疊峰。當(dāng)然也有可能是你pcr產(chǎn)物的問題。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我的產(chǎn)物是1.9K，送去上海生工測的，好像網(wǎng)上對生工測序反應(yīng)不太好，請教各位可有什么好的推薦，TAKARA測序如何？ 周_yan (站內(nèi)聯(lián)系TA) 上海博尚測序不錯。 bunny0512 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我在北京。。用華大基因 wangxueqin (站內(nèi)聯(lián)系TA) PCR產(chǎn)物的問題，可能目的片段不純，有雜事，或者是目的片段里面有AAAAAAAAAAAAAAAAAA之類的，也會造成出現(xiàn)雜峰 won7 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 如果在600bp以內(nèi)，峰比較尖但出現(xiàn)重疊峰，基本可以肯定是產(chǎn)物雜合，如二倍體或多倍體的核目的基因是雜合的。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我送樣的時候注明了是未純化的PCR產(chǎn)物，難道生工直接拿來測序了么？ 怎么都行 (站內(nèi)聯(lián)系TA) Originally posted by ztjren at 2010-08-25 11:56:34: 我送樣的時候注明了是未純化的PCR產(chǎn)物，難道生工直接拿來測序了么？ 對你這個問題而言產(chǎn)物雜合跟純不純化沒關(guān)系。如上樓所說，你如果是擴(kuò)增多倍體的某段基因序列，在某個堿基座位上本來就存在等位基因的差異或SNP，那你擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物雖然長度相同，但其實是雜和產(chǎn)物，產(chǎn)物分子的堿基序列不是統(tǒng)一的，你用PCR產(chǎn)物直接測序，在等位基因有差異或SNP位點(diǎn)上必然是套峰。這種情況你該克隆挑單菌落測序了。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 原來是這個意思，學(xué)習(xí)了，請教若真是多倍體的話等位基因上的差異怎么通過克隆來區(qū)分開來呢，還有即便測出序列了又如何能代表該多倍體的基因，不會用多條序列來表示吧？我不太懂可能問的比較幼稚，請大家賜教。 我擴(kuò)增的是肝吸蟲的18S 怎么都行 (站內(nèi)聯(lián)系TA) rRNA基因保守性很強(qiáng)，按說同一個物種的rDNA不該有差別，否則就變成另一個種群了。看來你的套峰還真有可能是測序本身的問題，套峰出現(xiàn)在什么位置，在測序結(jié)果的首尾還是中間？ ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 沒具體說重疊峰在什么位置，回郵件說再加大量測，結(jié)果又說沒信號 amilie030312 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 很可能是有條帶大小比較接近的非特異擴(kuò)增了，或者一些非特異擴(kuò)增的量還比較小在瓊脂糖膠上沒看出來。尤其是片段已經(jīng)達(dá)到了1.9個KP，這么長肯定是有問題的啦，建議你做克隆后再送測序，如果實在做不了克隆那就做一下二次PCR，看有沒有雜帶，然后再跑一下垂直板看看有沒有雜帶，如果都沒有那生工還測不出來那就讓他們直接能滾多遠(yuǎn)就滾多遠(yuǎn)吧，Takara的測序也那樣，沒和生工有啥差別，現(xiàn)在Takara已經(jīng)是國產(chǎn)試劑了，都是大連產(chǎn)的啦。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 如此看來產(chǎn)生重疊峰的原因有可能是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的雜帶，或者片段太長自身堿基互補(bǔ)造成的嗎， 若雜帶量小到電泳都看不出來，應(yīng)該不至于影響到測序吧，如果是條帶大小比較接近的非特異擴(kuò)增如何能通過克隆來區(qū)分呢，非目的基因不也會一起克隆進(jìn)去么？ |
6樓2014-05-30 16:17:06
BiologyDYJLU
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 0.9
- 帖子: 60
- 在線: 7.6小時
- 蟲號: 1717731
- 注冊: 2012-03-26
- 專業(yè): 分子與進(jìn)化生態(tài)學(xué)
7樓2014-05-30 16:34:23
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 追風(fēng)舞塵 的主題更新
| 7 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +12 | 申子申申 2026-03-19 | 18/900 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +3 | 濤濤Wjt 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0854電子信息求調(diào)劑 +3 | α____ 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 310求調(diào)劑 +4 | baibai1314 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿武理材料工程348求調(diào)劑 +5 | ￣^￣゜汗 2026-03-19 | 7/350 |
|
|
[基金申請] 山東省面上項目限額評審 +4 | 石瑞0426 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)調(diào)劑 +5 | yzysaa 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | @taotao 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4 | 妮妮ninicgb 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +9 | 煙火先于春 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 余意卿 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +12 | 呼呼呼。。。。 2026-03-17 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料工程（專）一志愿985 初試335求調(diào)劑 +3 | hiloiy 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑一志愿南京航空航天大學(xué)289分 +3 | @taotao 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 353求調(diào)劑 +3 | 拉鉤不許變 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 081700化工學(xué)碩調(diào)劑 +3 | 【1】 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 320求調(diào)劑0856
+3
|
不想起名字112 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程專碩求調(diào)劑 +10 | 慕寒mio 2026-03-16 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 344求調(diào)劑 +6 | knight344 2026-03-16 | 7/350 |
|
|
|
[考研] [導(dǎo)師推薦]西南科技大學(xué)國防/材料導(dǎo)師推薦 +3 | 尖角小荷 2026-03-16 | 6/300 |
|