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追風舞塵鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
測序結果出現(xiàn)單堿基的重疊峰 已有1人參與
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大家好�。� 我先設計了一對引物，分別對雌雄進行擴增，得到擴增片段進行測序，測序的結果序列都是一樣的，但是有個小問題，為什么其中一個堿基出現(xiàn)了重疊峰，其它堿基都沒有，不知道什么原因，又代表著什么意思？我這兩個序列都是克隆測序的，之前在另外一個擴增中也得出了相同的重疊峰 希望了解的高手們能給出答案��！ 實驗好急···  H4X，H4C比對.jpg |
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2樓2013-06-13 17:16:27
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4樓2013-06-14 09:06:03
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【答案】應助回帖
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請問在測序反應中某個堿基出現(xiàn)套峰，是否說明該等位基因是雜合子呢？ 初始懸賞金幣 10 個 請問在測序反應中某個堿基出現(xiàn)套峰，是否說明該等位基因是雜合子呢？ 套峰？我只知道那代表測序沒測好吧。你測了幾次？每次都一樣嗎。什么是雜合子。你拿什么去測的 在特定一個堿基上，測了三次，每次都有套峰。雜合子就是說等位基因在這個堿基的位置上是存在SNP的，所以會產(chǎn)生套峰。是不是這樣呢？ 如果只在某個堿基處有套峰，其他地方都沒有雜峰，那基本上就是雜合的。用反向引物再測一次，結果更準確。 那請問你是送的啥去測序？ 常用的方法1：pcr產(chǎn)物純化->回收連質(zhì)粒->轉化搖菌->平板挑單克隆->單克隆培養(yǎng)并PCR驗證->送菌液； 方法2：PCR產(chǎn)物純化->回收測濃度->送測序。 方法1的話，即便是雜合子也測不出來套峰……方法2的話，倒是有可能出套峰。 這個位置前后都一致么？是否雙向測序呢？位置附近的峰圖正常好看不？最好貼一下。 測序出現(xiàn)重疊峰是怎么回事？ 我是用PCR產(chǎn)物直接測序的，電泳圖上條帶很清楚也沒有拖尾巴，會出現(xiàn)雜帶嗎？還有我的產(chǎn)物里是含染料的會有影響嗎？ 周_yan (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我認為應該不是你說的這方面原因，而是測序時的問題，測序一個反應只能準確測700bp左右，超過這些就會測不準，出現(xiàn)重疊峰。當然也有可能是你pcr產(chǎn)物的問題。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我的產(chǎn)物是1.9K，送去上海生工測的，好像網(wǎng)上對生工測序反應不太好，請教各位可有什么好的推薦，TAKARA測序如何？ 周_yan (站內(nèi)聯(lián)系TA) 上海博尚測序不錯。 bunny0512 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我在北京。。用華大基因 wangxueqin (站內(nèi)聯(lián)系TA) PCR產(chǎn)物的問題，可能目的片段不純，有雜事，或者是目的片段里面有AAAAAAAAAAAAAAAAAA之類的，也會造成出現(xiàn)雜峰 won7 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 如果在600bp以內(nèi)，峰比較尖但出現(xiàn)重疊峰，基本可以肯定是產(chǎn)物雜合，如二倍體或多倍體的核目的基因是雜合的。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 我送樣的時候注明了是未純化的PCR產(chǎn)物，難道生工直接拿來測序了么？ 怎么都行 (站內(nèi)聯(lián)系TA) Originally posted by ztjren at 2010-08-25 11:56:34: 我送樣的時候注明了是未純化的PCR產(chǎn)物，難道生工直接拿來測序了么？ 對你這個問題而言產(chǎn)物雜合跟純不純化沒關系。如上樓所說，你如果是擴增多倍體的某段基因序列，在某個堿基座位上本來就存在等位基因的差異或SNP，那你擴增得到的PCR產(chǎn)物雖然長度相同，但其實是雜和產(chǎn)物，產(chǎn)物分子的堿基序列不是統(tǒng)一的，你用PCR產(chǎn)物直接測序，在等位基因有差異或SNP位點上必然是套峰。這種情況你該克隆挑單菌落測序了。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 原來是這個意思，學習了，請教若真是多倍體的話等位基因上的差異怎么通過克隆來區(qū)分開來呢，還有即便測出序列了又如何能代表該多倍體的基因，不會用多條序列來表示吧？我不太懂可能問的比較幼稚，請大家賜教。 我擴增的是肝吸蟲的18S 怎么都行 (站內(nèi)聯(lián)系TA) rRNA基因保守性很強，按說同一個物種的rDNA不該有差別，否則就變成另一個種群了�？磥砟愕奶追暹�真有可能是測序本身的問題，套峰出現(xiàn)在什么位置，在測序結果的首尾還是中間？ ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 沒具體說重疊峰在什么位置，回郵件說再加大量測，結果又說沒信號 amilie030312 (站內(nèi)聯(lián)系TA) 很可能是有條帶大小比較接近的非特異擴增了，或者一些非特異擴增的量還比較小在瓊脂糖膠上沒看出來。尤其是片段已經(jīng)達到了1.9個KP，這么長肯定是有問題的啦，建議你做克隆后再送測序，如果實在做不了克隆那就做一下二次PCR，看有沒有雜帶，然后再跑一下垂直板看看有沒有雜帶，如果都沒有那生工還測不出來那就讓他們直接能滾多遠就滾多遠吧，Takara的測序也那樣，沒和生工有啥差別，現(xiàn)在Takara已經(jīng)是國產(chǎn)試劑了，都是大連產(chǎn)的啦。 ztjren (站內(nèi)聯(lián)系TA) 如此看來產(chǎn)生重疊峰的原因有可能是非特異性擴增產(chǎn)生的雜帶，或者片段太長自身堿基互補造成的嗎， 若雜帶量小到電泳都看不出來，應該不至于影響到測序吧，如果是條帶大小比較接近的非特異擴增如何能通過克隆來區(qū)分呢，非目的基因不也會一起克隆進去么？ |
6樓2014-05-30 16:17:06
BiologyDYJLU
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7樓2014-05-30 16:34:23
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