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凡凡高高高金蟲 (小有名氣)
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[求助]
克隆擬南芥的基因，為什么每次測序結(jié)果出來都是比TAIR網(wǎng)站上標注的序列多出20個堿基呢
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| 最近在做載體構(gòu)建，但是在克隆上就出現(xiàn)了問題，使得實驗難有進展，以cDNA做模板，為什么每次克隆出來的得基因序列都比TAIR網(wǎng)站上標注的序列多出20個堿基呢？是網(wǎng)站上的信息錯誤還是操作的原因？又該怎么應(yīng)對這種情況呢？求大神指點 |
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2樓2013-02-22 12:41:02
凡凡高高高
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3樓2013-02-22 17:40:56
4樓2013-02-23 10:47:40
zgb1982
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5樓2013-02-23 17:07:57
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6樓2013-02-26 16:57:12
7樓2013-02-26 17:39:36
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8樓2013-08-23 18:50:59
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【答案】應(yīng)助回帖
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嗯............... 問下樓主的cDNA合成時用的OligodT還是OligodT和Random Hexamers混合方式？我以前采用后一種cDNA合成方式，擴一個較長的基因（大概3.5Kb）時就出現(xiàn)了融合有4bp的內(nèi)含子序列（其他均正確），當初分析的就是沒有用DNaseI處理RNA，導(dǎo)致gDNA微量存在，使擴增過程出現(xiàn)錯誤。因為實驗過程嫌DNaseI處理會損失RNA我就沒有做，其實這點很必要的。Random Hexamer是無節(jié)操性結(jié)合的引物，所以產(chǎn)生這種融合現(xiàn)象并不奇怪。 樓上各位說的variant也是可能的。TAIR并不是唯一。 所以嘛，和PCR有關(guān)的實驗怪異現(xiàn)象，非常之多，因為PCR本身就是一個神奇的技術(shù)~（笑） 個人看法，若有說錯請高手指點 |
9樓2013-08-23 19:44:45
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