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piscesghost金蟲 (小有名氣)
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[求助]
酵母克隆PCR技術(shù)求助
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本人最近在做酵母克隆PCR，現(xiàn)在是pPICZaA載體轉(zhuǎn)入GS115，挑克隆于YPD中過夜后PCR鑒定，取約100ul菌液離心，用ddH2O重懸后先100度10min，然后-80度10min，重復(fù)3次，離心取上清PCR，但是最近一直P不出來，或者條帶很淺，設(shè)置的程序是94度10min，94度45s，50度45s，72度1min，72度5min，35個(gè)循環(huán)。 請(qǐng)教做過酵母的高人指點(diǎn)，怎樣才能做好酵母克隆的PCR鑒定？？ 因?yàn)榭寺?shù)較多，要篩選的數(shù)量也較多，直接提基因組工作量太大，而且菌落PCR鑒定也只是一個(gè)初篩。之前用pPIC9K轉(zhuǎn)化的GS115和KM71時(shí)，做菌落PCR基本能P出條帶，但是現(xiàn)在突然P不出來了，所用凍融條件，PCR體系，程序等等條件都基本一致。還請(qǐng)高人指點(diǎn)，不勝感激��！ |
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