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[求助] PCR產(chǎn)物再次PCR無條帶只有彌散

如圖所示，左邊是兩道m(xù)arker（DL2000和wide range），前四個樣是一次PCR的產(chǎn)物，目的大小是3K，總見不著帶。然后就把PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，進行再次PCR，就出現(xiàn)了大片段的彌散，就是圖中后四個樣。一開始以為稀釋倍數(shù)不夠，還試過10000倍和100000倍，結(jié)果類似，彌散稍微弱一些，但是集中的條帶還是很大。求高人指點，這到底為啥啊？？？如何改進，才能獲得清晰的單帶��？

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1樓 2013-03-01 12:31:02

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先把DNA跑個膠看下質(zhì)量和大體濃度，如果是DNA問題則換新DNA，如果DNA沒有問題就調(diào)整引物濃度和退火溫度試試，如果還不行，就換其他引物把，可能是引物確實不特異。每一步都加陰陽對照最好。

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13樓2013-03-05 09:12:16

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

試試提高退火溫度，降低引物濃度，加入DMSO等方法。前兩者或者能解決問題。

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2樓2013-03-01 12:52:56

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

第一，檢測PCR模板；第二，提高退火溫度以增加特異性；第三，梯度稀釋，同時設(shè)陰性和陽性對照。

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3樓2013-03-01 12:59:18

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2樓: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
試試提高退火溫度，降低引物濃度，加入DMSO等方法。前兩者或者能解決問題。

這就做上試試~謝！

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4樓2013-03-01 21:06:54

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3樓: Originally posted by 瀟之天下 at 2013-03-01 12:59:18
第一，檢測PCR模板；第二，提高退火溫度以增加特異性；第三，梯度稀釋，同時設(shè)陰性和陽性對照。

怎么檢測PCR模板？您是指哪一步的模板�。恐x謝~

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5樓2013-03-01 21:07:34

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5樓: Originally posted by Hopig at 2013-03-01 21:07:34
怎么檢測PCR模板？您是指哪一步的模板啊？謝謝~...

您的第一次PCR產(chǎn)物是通過，RT-PCR獲得的嗎？如果是，電泳檢測下RNA的完整性。
左邊一次PCR產(chǎn)物特異性太差了，直接彌散了，估計可能是模板RNA或者引物設(shè)計的問題。
最好詳細說下你的實驗過程。希望對你有幫助吧！

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6樓2013-03-02 12:26:43

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6樓: Originally posted by 瀟之天下 at 2013-03-02 12:26:43
您的第一次PCR產(chǎn)物是通過，RT-PCR獲得的嗎？如果是，電泳檢測下RNA的完整性。
左邊一次PCR產(chǎn)物特異性太差了，直接彌散了，估計可能是模板RNA或者引物設(shè)計的問題。
最好詳細說下你的實驗過程。希望對你有幫助吧！...

我第一次PCR的模板直接就是DNA。產(chǎn)物大小3k，有小片段的彌散，應(yīng)該無所謂吧。問題是這樣的，之前擴增的產(chǎn)物很好，但就成功了一次，結(jié)果送測序還失敗了，之后擴增就沒有明顯的條帶了，所以才想二次PCR。

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7樓2013-03-02 15:32:20

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2樓: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
試試提高退火溫度，降低引物濃度，加入DMSO等方法。前兩者或者能解決問題。

您好~我今天做了檢測~提高退火溫度，設(shè)置的梯度，一直提了8℃，還是一樣的彌散。其實我很好奇，為什么會有那么多的大片段呢？

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8樓2013-03-02 15:34:20

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★
Hopig: 金幣+1, ★有幫助, 還是很感謝~ 2013-03-04 11:21:12

引用回帖:

7樓: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。產(chǎn)物大小3k，有小片段的彌散，應(yīng)該無所謂吧。問題是這樣的，之前擴增的產(chǎn)物很好，但就成功了一次，結(jié)果送測序還失敗了，之后擴增就沒有明顯的條帶了，所以才想二次PCR。...

二次PCR，加樣孔都有帶，真搞不懂這個基因的序列是要鬧哪樣。
敢問這個一次PCR的模板DNA存了多久了，怎么儲存的？
直接提的基因組DNA，有彌散屬于正常，第一次PCR富集后，還是彌散，而且引物被耗盡的話，可能就是引物的問題了。
你在網(wǎng)上多查查吧。
知識有限，愛莫能助。祝君順利！

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9樓2013-03-02 22:49:16

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覺得引物特異性不夠，改進一下引物，提高退火溫度。

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道法自然，探其精妙。

10樓2013-03-04 00:57:51

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