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Hopig

鐵蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] PCR產(chǎn)物再次PCR無(wú)條帶只有彌散

如圖所示，左邊是兩道m(xù)arker（DL2000和wide range），前四個(gè)樣是一次PCR的產(chǎn)物，目的大小是3K，總見(jiàn)不著帶。然后就把PCR產(chǎn)物稀釋1000倍，進(jìn)行再次PCR，就出現(xiàn)了大片段的彌散，就是圖中后四個(gè)樣。一開(kāi)始以為稀釋倍數(shù)不夠，還試過(guò)10000倍和100000倍，結(jié)果類似，彌散稍微弱一些，但是集中的條帶還是很大。求高人指點(diǎn)，這到底為啥�。�？？如何改進(jìn)，才能獲得清晰的單帶啊？

20130227.jpg

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1樓 2013-03-01 12:31:02

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瀟之天下

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【答案】應(yīng)助回帖

★
Hopig: 金幣+1, ★有幫助, 還是很感謝~ 2013-03-04 11:21:12

引用回帖:

7樓: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。產(chǎn)物大小3k，有小片段的彌散，應(yīng)該無(wú)所謂吧。問(wèn)題是這樣的，之前擴(kuò)增的產(chǎn)物很好，但就成功了一次，結(jié)果送測(cè)序還失敗了，之后擴(kuò)增就沒(méi)有明顯的條帶了，所以才想二次PCR。...

二次PCR，加樣孔都有帶，真搞不懂這個(gè)基因的序列是要鬧哪樣。
敢問(wèn)這個(gè)一次PCR的模板DNA存了多久了，怎么儲(chǔ)存的？
直接提的基因組DNA，有彌散屬于正常，第一次PCR富集后，還是彌散，而且引物被耗盡的話，可能就是引物的問(wèn)題了。
你在網(wǎng)上多查查吧。
知識(shí)有限，愛(ài)莫能助。祝君順利！

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9樓2013-03-02 22:49:16

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chenguestc

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

試試提高退火溫度，降低引物濃度，加入DMSO等方法。前兩者或者能解決問(wèn)題。

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2樓2013-03-01 12:52:56

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第一，檢測(cè)PCR模板；第二，提高退火溫度以增加特異性；第三，梯度稀釋，同時(shí)設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

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修行人

3樓2013-03-01 12:59:18

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引用回帖:

2樓: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
試試提高退火溫度，降低引物濃度，加入DMSO等方法。前兩者或者能解決問(wèn)題。

這就做上試試~謝！

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4樓2013-03-01 21:06:54

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