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cathereen_li新蟲 (初入文壇)
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[求助]
我要擴3kb的片段，人的GLDC基因，總是擴不出來，求大俠指點呀 已有2人參與
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| 我要擴增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，總是擴不出來，求大俠指點呀！！試過了各種辦法，兩步法也試過了，一開始用pfu酶，后來用taq酶，LA taq也用過了，都P不出來，用taqP出來了一個，但是大小不對。我的體系為25微升體系，程序與體系如下：94度，3分鐘；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30個循環(huán)；72度8分鐘。體系：上下游引物各一微升，模板視濃度而定，一般為2到5微升，buffer為2.5微升，dNTP為1.5微升，酶為1微升，補水到25微升。小女子論壇新手，金幣不太足，還請各位大俠多多包涵~~~~ |
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凌波麗
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- 專業(yè): 生物大分子結構與功能
- 管轄: 生物科學綜合
【答案】應助回帖
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長片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無糾錯功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當需要擴增的片段大于20kd時，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴增反應的溫度降低2-3度。樓主的擴增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點。 3.適當升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時間要短，尤其是一般不超過30 s，尤其是模板長度超過8KD時更是如此，變性時間長會破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時加長延伸反應時間，長度為3-5kd的模板延伸反應時間為5-10分鐘，長度為20-35kd的模板延伸反應時間為20分鐘。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應用長片段PCR緩沖溶液。10X長片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設計較長的PCR引物（25-30 bp) |
8樓2014-07-08 01:54:51
2樓2013-03-04 15:51:35
3樓2013-03-04 16:10:25
haitian0625
金蟲 (小有名氣)
- 應助: 7 (幼兒園)
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- 帖子: 123
- 在線: 56.9小時
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- 注冊: 2009-11-15
- 性別: GG
- 專業(yè): 基因表達調(diào)控與表觀遺傳學
4樓2013-03-04 21:59:21
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