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cathereen_li新蟲 (初入文壇)
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[求助]
我要擴(kuò)3kb的片段，人的GLDC基因，總是擴(kuò)不出來(lái)，求大俠指點(diǎn)呀 已有2人參與
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| 我要擴(kuò)增3kb的片段，人的GLDC基因的cDNA，總是擴(kuò)不出來(lái)，求大俠指點(diǎn)呀�。≡囘^(guò)了各種辦法，兩步法也試過(guò)了，一開始用pfu酶，后來(lái)用taq酶，LA taq也用過(guò)了，都P不出來(lái)，用taqP出來(lái)了一個(gè)，但是大小不對(duì)。我的體系為25微升體系，程序與體系如下：94度，3分鐘；94度，45秒，55度，40秒，72度3分半，30個(gè)循環(huán)；72度8分鐘。體系：上下游引物各一微升，模板視濃度而定，一般為2到5微升，buffer為2.5微升，dNTP為1.5微升，酶為1微升，補(bǔ)水到25微升。小女子論壇新手，金幣不太足，還請(qǐng)各位大俠多多包涵~~~~ |
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2樓2013-03-04 15:51:35
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3樓2013-03-04 16:10:25
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4樓2013-03-04 21:59:21
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5樓2013-03-06 20:58:30
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6樓2013-03-06 21:00:56
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7樓2013-03-06 21:03:26
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【答案】應(yīng)助回帖
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長(zhǎng)片段PC不同于一般PCR的特殊要求： 1.用Taq-LA DNA聚合酶，該酶是Taq酶或Klentaq 1（無(wú)糾錯(cuò)功能）與pfu酶或Deep Vent酶（有糾錯(cuò)功能）的混合物，以Taq酶為主。 2.當(dāng)需要擴(kuò)增的片段大于20kd時(shí)，需要加入高濃度的甜茶堿（終濃度為1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶堿加入后，要將擴(kuò)增反應(yīng)的溫度降低2-3度。樓主的擴(kuò)增片段還到不了2020kd,甜茶堿可以少加點(diǎn)。 3.適當(dāng)升高鎂離子濃度，不要太高了鎂離子濃度高于底物dNTP濃度即可。 4.變性時(shí)間要短，尤其是一般不超過(guò)30 s，尤其是模板長(zhǎng)度超過(guò)8KD時(shí)更是如此，變性時(shí)間長(zhǎng)會(huì)破壞模板。 5.延伸溫度可以下降為68攝氏度，同時(shí)加長(zhǎng)延伸反應(yīng)時(shí)間，長(zhǎng)度為3-5kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘，長(zhǎng)度為20-35kd的模板延伸反應(yīng)時(shí)間為20分鐘。 6.模板濃度最好在1ng/L以內(nèi)。 7.應(yīng)用長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液。10X長(zhǎng)片段PCR緩沖溶液組成為：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸銨，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.設(shè)計(jì)較長(zhǎng)的PCR引物（25-30 bp) |
8樓2014-07-08 01:54:51
凌波麗
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9樓2014-07-08 02:03:26
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10樓2014-07-08 12:38:20
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