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帆蚌俠新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR設計引物算Tm和CG含量的問題，help，help 已有2人參與
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1，本人設計了一系列引物，引物的5端加了酶切位點和保護堿基，那在計算引物的Tm和CG時，要不要把酶切位點和保護堿基也算進去？ 2，還有就是為什么p不出目的片段啊，崩潰了，目的片段3.6kb長。跑了好久都沒跑出來。退火溫度已經(jīng)從60降到47了，循環(huán)次數(shù)也已經(jīng)從35加到40，昨天跑膠就只是出來2kb左右的片段。由于是要用來表達蛋白質的，所以擴目的片段的時候只能把目的片段完整的擴出來，所以引物的位置沒得選，我所能做的只能改變引物的長度。 大神們，help |
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2樓2014-10-16 14:10:35
Allison_Sue
鐵蟲 (初入文壇)
- 應助: 2 (幼兒園)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學
【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
帆蚌俠(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-10-16 14:53:54
感謝參與，應助指數(shù) +1
帆蚌俠(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵回帖交流 2014-10-16 14:53:54
| 以我自身實踐提供點思路吧，前段時間也很掙扎。。。一般用PP5設計3，4對引物，看著評分還好，錯配不多就可以，不用特別在意GC之類，按建議的Ta opt值增減2-3℃做個梯度肯定能P出來，都對了就是一次性就可以。如果一直做不行的話，說明可能你拿來設計的基因組就跟你實際菌的基因組有較大差別，換個編號的同菌種基因組試一試。也可能引物設計的不對，這個方面可以讓師兄師姐幫你參考。不知道你延伸的時間設置的多少，如果用的taq DNA 聚合酶，延伸速度一般是一分鐘1kb，那么你就至少得設4分鐘，注意按你買的酶來設置延伸時間，不行換換聚合酶也是可以的。循環(huán)數(shù)一般30-35就夠了。另外，保護堿基和內(nèi)切酶位點堿基在計算Tm時不予考慮，我因為后續(xù)試驗設計沒有加酶切位點和保護堿基，你可以先直接PP看，P出來再加上酶切位點和保護堿基。 |
3樓2014-10-16 14:50:39
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