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帆蚌俠新蟲 (初入文壇)
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PCR設(shè)計(jì)引物算Tm和CG含量的問(wèn)題，help，help 已有2人參與
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1，本人設(shè)計(jì)了一系列引物，引物的5端加了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，那在計(jì)算引物的Tm和CG時(shí)，要不要把酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基也算進(jìn)去？ 2，還有就是為什么p不出目的片段啊，崩潰了，目的片段3.6kb長(zhǎng)。跑了好久都沒(méi)跑出來(lái)。退火溫度已經(jīng)從60降到47了，循環(huán)次數(shù)也已經(jīng)從35加到40，昨天跑膠就只是出來(lái)2kb左右的片段。由于是要用來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)的，所以擴(kuò)目的片段的時(shí)候只能把目的片段完整的擴(kuò)出來(lái)，所以引物的位置沒(méi)得選，我所能做的只能改變引物的長(zhǎng)度。 大神們，help |
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2樓2014-10-16 14:10:35
Allison_Sue
鐵蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
帆蚌俠(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-16 14:53:54
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帆蚌俠(西門吹雪170代發(fā)): 金幣+3, 鼓勵(lì)回帖交流 2014-10-16 14:53:54
| 以我自身實(shí)踐提供點(diǎn)思路吧，前段時(shí)間也很掙扎。。。一般用PP5設(shè)計(jì)3，4對(duì)引物，看著評(píng)分還好，錯(cuò)配不多就可以，不用特別在意GC之類，按建議的Ta opt值增減2-3℃做個(gè)梯度肯定能P出來(lái)，都對(duì)了就是一次性就可以。如果一直做不行的話，說(shuō)明可能你拿來(lái)設(shè)計(jì)的基因組就跟你實(shí)際菌的基因組有較大差別，換個(gè)編號(hào)的同菌種基因組試一試。也可能引物設(shè)計(jì)的不對(duì)，這個(gè)方面可以讓師兄師姐幫你參考。不知道你延伸的時(shí)間設(shè)置的多少，如果用的taq DNA 聚合酶，延伸速度一般是一分鐘1kb，那么你就至少得設(shè)4分鐘，注意按你買的酶來(lái)設(shè)置延伸時(shí)間，不行換換聚合酶也是可以的。循環(huán)數(shù)一般30-35就夠了。另外，保護(hù)堿基和內(nèi)切酶位點(diǎn)堿基在計(jì)算Tm時(shí)不予考慮，我因?yàn)楹罄m(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)沒(méi)有加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，你可以先直接PP看，P出來(lái)再加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。 |
3樓2014-10-16 14:50:39
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