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sc5921041木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[求助]
求助! GST-tag 重組蛋白純化
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將目的蛋白片段連接到GST載體上，已酶切驗(yàn)證連接成功。 但是IPTG 誘導(dǎo)， GST beads 結(jié)合后洗脫竟然完全沒(méi)有蛋白，連GST蛋白和雜帶都沒(méi)有！ 重復(fù)了三次都這樣，求分析原因！！ 已排除IPTG， GST beads 和GST 洗脫液的問(wèn)題。BL21 和DH5α 都試過(guò)了... 難道是蛋白就不表達(dá)？？？是菌的問(wèn)題？？？以前做過(guò)同樣的操作，沒(méi)有遇見(jiàn)這樣的問(wèn)題，至少也有GST的帶。 做的我連實(shí)驗(yàn)最基本的操作都沒(méi)信心了�。。� 求指導(dǎo)  |
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gaojuan1985
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2樓2013-03-13 12:57:58
linxt2005
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
sc5921041: 金幣+3, ★有幫助 2013-03-13 21:19:29
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表達(dá)測(cè)試后先進(jìn)行SDS-PAGE甚至WB/elisa檢測(cè)，確認(rèn)目的蛋白有表達(dá)，然后再進(jìn)行層析測(cè)試。 從你表述上來(lái)看，如果構(gòu)建沒(méi)有問(wèn)題的話，可能是沒(méi)有表達(dá)； 另外，層析后檢測(cè)是可有添加上樣前、穿透的泳道，有可能目的蛋白表達(dá)了但沒(méi)有與填料結(jié)合。 |
3樓2013-03-13 13:02:51
sc5921041
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4樓2013-03-13 21:20:41
xyoung88
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5樓2013-03-14 02:26:47
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