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[交流] 使用多對引物進(jìn)行實時定量PCR后未得到實驗結(jié)果，是否能說明目的基因不表達(dá)？

本人想檢測體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞內(nèi)CRHR2 mRNA的表達(dá)，設(shè)計了十多對引物，合成后進(jìn)行實時定量PCR檢測，但是都沒有得到Ct值，說明沒把基因擴(kuò)增出來。這樣是不是能說明這種基因在體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞內(nèi)無mRNA的表達(dá)？本人設(shè)計的引物都經(jīng)過嚴(yán)格的驗證，雖然引物有可能無效，但不應(yīng)該都不好使呀。檢測某種基因受否表達(dá)的要求和方法有沒有標(biāo)準(zhǔn)啊？我這樣下結(jié)論對嗎？論文里可不可以這么寫？

[ Last edited by A06060054 on 2013-3-22 at 11:19 ]

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做正對照了嗎？比方說內(nèi)參是不是可以P出來？

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2樓2013-03-22 12:35:28

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joan198108

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你的RNA質(zhì)量如何，反轉(zhuǎn)率效率呢，我覺得最好用這些引物先做個普通的RT-PCR檢測一下上面的問題，當(dāng)然，跟樓上所說，做個內(nèi)標(biāo)基因做參照，這樣才能更好的說明問題

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3樓2013-03-22 16:19:38

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設(shè)計引物參考的序列跟生物體實際的序列是否一致？也就是說，失敗那么多，有沒有用基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序證明有這個基因？內(nèi)參做出來了嗎？

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4樓2013-03-22 17:49:48

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2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-22 12:35:28
做正對照了嗎？比方說內(nèi)參是不是可以P出來？

正對照是什么？是陽性對照嗎？內(nèi)參我做出來了啊，每個孔Ct值都是19點多。

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5樓2013-03-23 09:08:08

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3樓: Originally posted by joan198108 at 2013-03-22 16:19:38
你的RNA質(zhì)量如何，反轉(zhuǎn)率效率呢，我覺得最好用這些引物先做個普通的RT-PCR檢測一下上面的問題，當(dāng)然，跟樓上所說，做個內(nèi)標(biāo)基因做參照，這樣才能更好的說明問題

內(nèi)參做出來了，Ct值比較理想，確定模板沒有問題啊。就是目的基因沒有結(jié)果，也沒做普通PCR啊！有必要嗎？普通PCR驗證引物好使做實時一定好使嗎？

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6樓2013-03-23 09:11:21

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4樓: Originally posted by 547star at 2013-03-22 17:49:48
設(shè)計引物參考的序列跟生物體實際的序列是否一致？也就是說，失敗那么多，有沒有用基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序證明有這個基因？內(nèi)參做出來了嗎？

設(shè)計引物時基因序列是從NCBI上得到，動物種屬也一致，基因組DNA應(yīng)該是有這個基因吧！就是不知道在脾臟細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)？所以這么做的。結(jié)果目的基因沒做出來，內(nèi)參做出來了，內(nèi)參Ct值也比較理想啊。

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7樓2013-03-23 09:14:16

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5樓: Originally posted by A06060054 at 2013-03-23 09:08:08
正對照是什么？是陽性對照嗎？內(nèi)參我做出來了啊，每個孔Ct值都是19點多。...

你的引物如果能夠P出基因組DNA，對從RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA卻無法檢出，而樣品可以正常擴(kuò)增出內(nèi)參，至少可以說明目的基因表達(dá)水平很低。此外，你可以試試增加cDNA用量來P，看是否能P出來。

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8樓2013-03-23 09:16:20

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7樓: Originally posted by A06060054 at 2013-03-23 09:14:16
設(shè)計引物時基因序列是從NCBI上得到，動物種屬也一致，基因組DNA應(yīng)該是有這個基因吧！就是不知道在脾臟細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)？所以這么做的。結(jié)果目的基因沒做出來，內(nèi)參做出來了，內(nèi)參Ct值也比較理想啊。...

再在已經(jīng)報道的其他能夠表達(dá)的組織中進(jìn)行擴(kuò)增，如果能夠檢測出來，就說明在實驗組織表達(dá)很低或沒有。

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9樓2013-03-24 08:43:17

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首先檢查一下RNA質(zhì)量。
其次確定內(nèi)參能擴(kuò)出來，且Ct值比較正常
最后實驗一定要有正對照，陰性結(jié)果什么都說明不了。你應(yīng)該加上基因組DNA作為正對照

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10樓2013-03-24 15:30:35

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我們做植物的一般可以做個野生型的對照，這樣的話反轉(zhuǎn)錄的質(zhì)量就不用考慮了，因為野生型還擴(kuò)不出來那肯定是反轉(zhuǎn)錄沒做好，不知道你這個是不是可以做個對照，樓上說的陽性對照就是這個意思，讓你找一個確定表達(dá)該基因的樣品做對照，其實引物不是很大問題，一般軟件設(shè)計的都可以擴(kuò)出來。

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11樓2013-03-25 18:47:24

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