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神話米亞新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蟲友們！請(qǐng)教大家關(guān)于腸道菌DNA提取的問(wèn)題
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以下是我的提取過(guò)程，不吝賜教哈 1）將腸道研磨物500r/min離心5min,收集上清液，重復(fù)2次。將腸道微生物12000r/min離心10min沉淀，去上清液。加入480μL TE緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。 2）加入20μL 100mg/ml溶菌酶，使終濃度為4mg/mL，37°C溫育20min。 3）加入30μL 10% SDS 和5μL 20mg/mL蛋白酶K，混勻，56°C溫育40min。（期間可以輕柔振蕩幾次幫助裂解。） 4）加入100μL 5mol/LNaCl，充分混勻，再加入85μL CTAB/NaCl，混勻，65°C溫育10min。 5）等體積（720ul）苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提兩次，12000r/min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管中。第一次抽提后，加5μL 25mg/mlRNA酶，振蕩均勻，37度水浴8min，之后進(jìn)行第二次抽提。 6）加入0.6體積（450ul）異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)(冰箱靜至半小時(shí)讓DNA沉淀)12000r/min離心10min。 7）加入1mL 70%冰乙醇洗滌，（渦旋震蕩起沉淀數(shù)秒鐘）離心5min，棄上清，自然通風(fēng)干燥20min，重溶于10μL的TE緩沖液中（65°C下水浴1小時(shí)重溶）。 將提取的總DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 希望大家?guī)臀铱纯从袥](méi)有問(wèn)題哈。讓我比較頭疼是RNA酶要在什么時(shí)候加比較好，因?yàn)榧油暌屗鹱饔茫忠罱K除去。有考慮過(guò)在第三、四步的時(shí)候加，但是RNA酶怕蛋白酶K 和CTAB。所以就在抽提第一次后加，再在第二次抽提的時(shí)候除去。不知道可不可以？另外的問(wèn)題是大家?guī)臀铱纯锤鞣N試劑加的量有沒(méi)有特別不合適的地方？》 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 |
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神話米亞
新蟲 (初入文壇)
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3樓2013-03-26 20:21:33
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2樓2013-03-25 22:54:02
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