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c_yl銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
求助~~~~~PCR產(chǎn)物條帶分析
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我做的是PCR溫度梯度，反向引物設(shè)計(jì)了兩個(gè)，圖片上六個(gè)條帶兩個(gè)兩個(gè)是一組，總共三組，但是疑惑的是第四個(gè)條帶怎么突然很亮，而且還不知道哪個(gè)溫度比較適合 79 條件 3.27.jpg |
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c_yl
銀蟲 (初入文壇)
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8樓2013-03-31 09:53:19
【答案】應(yīng)助回帖
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| 額網(wǎng)上找的樓主將就看看 降落PCR（即touchdown PCR）是一種增加PCR反應(yīng)特異性的優(yōu)化方法。一般情況下，解決PCR非特異性擴(kuò)增的方法是通過調(diào)整Mg++濃度或改變退火溫度等來實(shí)現(xiàn)的，但這些方法既煩瑣又耗時(shí)，Touchdown PCR利用一種簡(jiǎn)單的手段克服了這些復(fù)雜的問題。其基本原理是：設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)程序以使相連循環(huán)的退火溫度越來越底。由于開始時(shí)的退火溫度選擇為高于估計(jì)的Tm值，隨著循環(huán)的進(jìn)行，退火溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個(gè)水平。這個(gè)策略有利于確保第一個(gè)引物摸板雜交事件發(fā)生在最互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，即那些生產(chǎn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)物之間。盡管退火溫度最終會(huì)降到非特異性雜交的Tm值，但此時(shí)目的擴(kuò)增物已開始幾何擴(kuò)增，在剩下的循環(huán)中處于超過任何滯后（非特異）PCR產(chǎn)物的地位。由于目標(biāo)是在較早的循環(huán)中避免低Tm值配對(duì)，在Touchdown PCR中，必須應(yīng)用熱啟動(dòng)技術(shù)（hotstart）。編設(shè)Touchdown PCR程序的目的是要涉及一系列退火溫度越來越低的循環(huán)，退火溫度的范圍應(yīng)該跨越15℃左右，從高于估計(jì)Tm值至少幾度到低于它10℃左右。例如：如果一對(duì)引物的計(jì)算Tm值為63℃，可設(shè)定PCR儀的退火溫度從66℃降到50℃（每兩個(gè)循環(huán)降低退火溫度1℃），再在50℃退火溫度下做15個(gè)循環(huán)。如果在Touchdown PCR中，持續(xù)出現(xiàn)假象帶表明起始退火溫度太低，或者目的擴(kuò)增產(chǎn)物和非目的產(chǎn)物的Tm值相差無幾，和（或）非目的擴(kuò)增物以更高的效率擴(kuò)增。把退火溫度每降低1℃時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)增加到3或4，有可能在非目的產(chǎn)物開始擴(kuò)增以前給目的產(chǎn)物增加競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這時(shí)，應(yīng)從程序的末尾去掉相應(yīng)的循環(huán)數(shù)，以避免過度循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的降解和產(chǎn)生高分子量成片產(chǎn)物。 |
9樓2013-03-31 10:30:24
小科研女dow
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【答案】應(yīng)助回帖
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其實(shí)做實(shí)驗(yàn) 目的達(dá)到就好 不必要非選出最佳的溫度 你可以直接做一個(gè)touchdown來P你的條帶 檢測(cè)出結(jié)果如果條帶很亮就說明你P的濃度高 但是確實(shí)也不影響你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)吧 你這個(gè)突然很亮的原因我猜測(cè)也不一定就是溫度低呃影響 畢竟3號(hào)不一樣 所以可能就是偶然性結(jié)果導(dǎo)致的 比如說這管的酶的濃度剛好是下層的沒有混勻?qū)е旅付喈a(chǎn)物濃度高 |
2樓2013-03-29 20:13:17
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5樓2013-03-30 23:06:36
小丫丫———
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c_yl
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