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yuguiyan至尊木蟲 (文壇精英)
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[求助]
熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的要求
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| 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)要求primer-blast的結(jié)果特異性很好嗎？具體有什么要求，本人新手，只會(huì)設(shè)計(jì)PCR引物，望高手賜教！另外想知道熒光定量96孔板應(yīng)該如何布局，有空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組和處理組 |
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新蟲 (初入文壇)
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)新蟲發(fā)貼交流！ 2013-04-02 20:36:48
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qPCR 的引物基本要求與一般PCR的要求差不多，產(chǎn)物長度一般在80-150bp。對(duì)特異性的要求比較高，通常引物設(shè)計(jì)軟件給出的結(jié)果也需要實(shí)驗(yàn)的具體優(yōu)化，做standard curve看引物的擴(kuò)增效率，melt curve中一個(gè)峰的話，引物特異性一般比較好。另外引物的Ta 也要考慮所用的qPCR酶的相關(guān)溫度。 96孔板中有control cDNA + reference gene primer, control cDNA + target gene primer, treatment cDNA + reference gene primer 和 treatment cDNA + target gene primer 這樣的組合，另外要有像lz說的 no RT control, negative control. 另外也與所選用的定量方法有關(guān)，absolute quantification或是relative quantification. 希望以上有幫助。 |
2樓2013-04-02 00:14:49
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