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Le_science新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
引物和測(cè)序
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最近做試驗(yàn)，老師給了一段序列。然后用顏色標(biāo)記了，前面10多個(gè)堿基設(shè)計(jì)成了forward primer, 后面的堿基反向設(shè)計(jì)成了reverse primer. 然后跑PCR，看能不能擴(kuò)得出，然后接著好像是克隆，然后測(cè)序。 我有問(wèn)題不明白。既然序列都給了，為什么還要測(cè)序啊，這樣測(cè)出來(lái)的不就是兩個(gè)引物之間的序列么。第二，為什么不直接PCR，純化，測(cè)序；而要來(lái)個(gè)克隆測(cè)全長(zhǎng)��？而且老師給引物后就讓跑PCR， 然后看下能不能P出來(lái)，這樣P一下的意義是什么��？？看引物行不行？程序OK不？ |
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xy656691
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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一。測(cè)序是為了確定你克隆出來(lái)的載體中連接的目的基因序列和老師給的是否一樣，因?yàn)樵诤罄m(xù)的PCR中會(huì)有堿基發(fā)生錯(cuò)配，導(dǎo)致序列中個(gè)別堿基發(fā)生變化。 二。直接PCR，純化測(cè)序，估計(jì)是沒(méi)有多大意義吧�？寺≈竽媒o測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序時(shí)還要把自己引物告訴他們，別人并不是測(cè)全長(zhǎng)的，只是測(cè)目的基因序列。 P的意義是看引物行不行，程序OK不。 |
2樓2013-04-02 13:08:17
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
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- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| PCR時(shí)候會(huì)有錯(cuò)配幾率的，所以經(jīng)過(guò)PCR后的需要測(cè)序驗(yàn)證克隆序列的正確性。PCR產(chǎn)物跑電泳雖然看起來(lái)是一條帶，實(shí)際上反應(yīng)是經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)把模板片段大量擴(kuò)增出來(lái)的，很可能是分子量接近的不同分子，所以需要克隆后挑單克隆再測(cè)序。因?yàn)槊總�(gè)克隆出來(lái)的序列是插入了一個(gè)分子形成的，而純化PCR產(chǎn)物測(cè)序的話本身可能就是一個(gè)混合物，最后那個(gè)分子連到載體里面去還不知道。用導(dǎo)師給的引物PCR是驗(yàn)證引物是否能進(jìn)行克隆或者其他實(shí)驗(yàn)。 |
3樓2013-04-02 15:55:43
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