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Le_science新蟲 (初入文壇)
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[求助]
引物和測序
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最近做試驗，老師給了一段序列。然后用顏色標(biāo)記了，前面10多個堿基設(shè)計成了forward primer, 后面的堿基反向設(shè)計成了reverse primer. 然后跑PCR，看能不能擴(kuò)得出，然后接著好像是克隆，然后測序。 我有問題不明白。既然序列都給了，為什么還要測序啊，這樣測出來的不就是兩個引物之間的序列么。第二，為什么不直接PCR，純化，測序；而要來個克隆測全長��？而且老師給引物后就讓跑PCR， 然后看下能不能P出來，這樣P一下的意義是什么啊？？看引物行不行？程序OK不？ |
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cicelyzh
鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| PCR時候會有錯配幾率的，所以經(jīng)過PCR后的需要測序驗證克隆序列的正確性。PCR產(chǎn)物跑電泳雖然看起來是一條帶，實際上反應(yīng)是經(jīng)過多個循環(huán)把模板片段大量擴(kuò)增出來的，很可能是分子量接近的不同分子，所以需要克隆后挑單克隆再測序。因為每個克隆出來的序列是插入了一個分子形成的，而純化PCR產(chǎn)物測序的話本身可能就是一個混合物，最后那個分子連到載體里面去還不知道。用導(dǎo)師給的引物PCR是驗證引物是否能進(jìn)行克隆或者其他實驗。 |
3樓2013-04-02 15:55:43
xy656691
金蟲 (正式寫手)
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2樓2013-04-02 13:08:17
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