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Le_science新蟲 (初入文壇)
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[求助]
引物和測(cè)序
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最近做試驗(yàn)，老師給了一段序列。然后用顏色標(biāo)記了，前面10多個(gè)堿基設(shè)計(jì)成了forward primer, 后面的堿基反向設(shè)計(jì)成了reverse primer. 然后跑PCR，看能不能擴(kuò)得出，然后接著好像是克隆，然后測(cè)序。 我有問題不明白。既然序列都給了，為什么還要測(cè)序啊，這樣測(cè)出來的不就是兩個(gè)引物之間的序列么。第二，為什么不直接PCR，純化，測(cè)序；而要來個(gè)克隆測(cè)全長(zhǎng)��？而且老師給引物后就讓跑PCR， 然后看下能不能P出來，這樣P一下的意義是什么啊？？看引物行不行？程序OK不？ |
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2樓2013-04-02 13:08:17
cicelyzh
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| PCR時(shí)候會(huì)有錯(cuò)配幾率的，所以經(jīng)過PCR后的需要測(cè)序驗(yàn)證克隆序列的正確性。PCR產(chǎn)物跑電泳雖然看起來是一條帶，實(shí)際上反應(yīng)是經(jīng)過多個(gè)循環(huán)把模板片段大量擴(kuò)增出來的，很可能是分子量接近的不同分子，所以需要克隆后挑單克隆再測(cè)序。因?yàn)槊總�(gè)克隆出來的序列是插入了一個(gè)分子形成的，而純化PCR產(chǎn)物測(cè)序的話本身可能就是一個(gè)混合物，最后那個(gè)分子連到載體里面去還不知道。用導(dǎo)師給的引物PCR是驗(yàn)證引物是否能進(jìn)行克隆或者其他實(shí)驗(yàn)。 |
3樓2013-04-02 15:55:43
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