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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR之 擴增效率
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大家好，做實時定量PCR以前都是用Thermo的試劑盒最近改用promega的，同個基因相同的退火溫度，溶解曲線卻不同，如下圖，promega的溶解曲線圈出部分熒光強度為負值，這樣正常嗎？應(yīng)該如何改進呢？？謝謝 promega.jpg thermo.jpg |
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4樓2013-04-04 23:14:01
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| 溶解曲線主要是看有沒有非特異的峰，用來判斷引物擴增的特異性的，開始幾個溫度內(nèi)熒光呈現(xiàn)負值屬正常現(xiàn)象，這可能是儀器本身的原因，你的溶解曲線很好，不用做改進了。 |
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shiliyusly2樓2013-04-04 21:16:36
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| 不知道你的引物的退火溫度是多少。在溫度較低的情況下，可能是引物與模板發(fā)生了anealing，造成雙鏈DNA增加，所以熒光增加，對于熔接曲線來說會產(chǎn)生一點負值區(qū)域也屬于正常的。一般這種情況下，可以把做熔接曲線的起始溫度稍微提高一些，一般是Tm+5°C開始就可以了。不同的盒子這方面不太一樣也是可能的。熔接曲線主要看產(chǎn)物是否單一，我覺得你的這個熔接曲線還是不錯的。至于擴增效率問題，需要做標準曲線。不到90%是有些低，你是否優(yōu)化了退火溫度？ |
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5樓2013-04-05 00:07:07
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