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shiliyusly新蟲 (小有名氣)
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[求助]
QPCR之 擴(kuò)增效率
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大家好，做實(shí)時(shí)定量PCR以前都是用Thermo的試劑盒最近改用promega的，同個基因相同的退火溫度，溶解曲線卻不同，如下圖，promega的溶解曲線圈出部分熒光強(qiáng)度為負(fù)值，這樣正常嗎？應(yīng)該如何改進(jìn)呢？？謝謝 promega.jpg thermo.jpg |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 實(shí)驗(yàn)方法 |
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gyesang
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| 溶解曲線主要是看有沒有非特異的峰，用來判斷引物擴(kuò)增的特異性的，開始幾個溫度內(nèi)熒光呈現(xiàn)負(fù)值屬正常現(xiàn)象，這可能是儀器本身的原因，你的溶解曲線很好，不用做改進(jìn)了。 |
shiliyusly
2樓2013-04-04 21:16:36
shiliyusly
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cicelyzh
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| 不知道你的引物的退火溫度是多少。在溫度較低的情況下，可能是引物與模板發(fā)生了anealing，造成雙鏈DNA增加，所以熒光增加，對于熔接曲線來說會產(chǎn)生一點(diǎn)負(fù)值區(qū)域也屬于正常的。一般這種情況下，可以把做熔接曲線的起始溫度稍微提高一些，一般是Tm+5°C開始就可以了。不同的盒子這方面不太一樣也是可能的。熔接曲線主要看產(chǎn)物是否單一，我覺得你的這個熔接曲線還是不錯的。至于擴(kuò)增效率問題，需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。不到90%是有些低，你是否優(yōu)化了退火溫度？ |
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5樓2013-04-05 00:07:07
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退火溫度為58度，我把5倍濃度的模板進(jìn)行5倍稀釋度稀釋成5個濃度梯度做的擴(kuò)增效率曲線，擴(kuò)增效率只有70%左右，然后我把退火溫度降了2度，可是擴(kuò)增效率差不多。溶解曲線的溫度就是儀器給出的95度30秒，60度1分鐘，95度15秒，60度15秒，以前用thermo試劑盒都是這樣的程序，從沒出現(xiàn)過這么大范圍的負(fù)值。 7樓2013-04-05 10:42:25
cicelyzh
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8樓2013-04-05 23:50:00
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9樓2013-04-06 10:01:11
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