zhoujlhn

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[求助] 豬糞中細(xì)菌總DNA的提取

小弟最近在提取豬糞中細(xì)菌的總DNA，老板說(shuō)要自己摸索方法，沒(méi)有考慮過(guò)用試劑盒，但是怎么提都沒(méi)有提出來(lái)，請(qǐng)教各位前輩，有誰(shuí)做過(guò)這一塊的，請(qǐng)你給小弟我支支招！先謝謝了！

下面是我用的方法：
樣品的前處理：
稱取0.3g糞樣放入2ml離心管中，加入1.5mlPBS（ph8.0）溶液，旋渦振蕩混勻，4℃，800rpm離心10min;吸上清液轉(zhuǎn)入另一干凈2ml離心管中，4℃， 1000rpm離心 10min;再將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈 2ml離心管中，重復(fù)此步驟，直至離心后上清液有菌體渾濁感為止；最后將上清液4℃，13000rpm離心5分鐘，棄上清，收集沉淀。將沉淀用適量丙酮洗滌，并轉(zhuǎn)入到 1.5ml離心管中，旋渦振蕩混勻， 4℃，13000rpm離心5分鐘，棄上清。用丙酮洗滌兩次后，收集沉淀自然干燥或吹干
細(xì)胞裂解及DNA抽提：
1、經(jīng)過(guò)前處理后的樣品，加600μL TE，20μL溶菌酶 (100mg/ml)，輕輕顛倒混勻，于37℃放置 30min;
2、加入15μL蛋白酶K，500μL裂解液，55℃溫浴3-4h，每 20min輕輕顛倒混勻一次;
3、然后加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，輕輕混成乳濁液， 4℃，13000rpm離心10min，小心吸上相至空管中;
4、再加等體積的氯仿/異戊醇(24:l)輕輕顛倒混勻，13000rpm離心 10min，小心吸上相至空管中;加等體積的異丙醇，-20℃沉淀過(guò)夜;
5、將DNA樣品取出，13000rpm離心20min，倒去異丙醇，用80%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心 10min，棄上清，并將異丙醇吹干;
6、將DNA溶于60μL TE，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-70℃保存.

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1樓 2013-04-11 19:57:23

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要進(jìn)行預(yù)備處理，去除色素，抑制性物質(zhì)等。用PBS溶液處理等，你可以參考下土壤總DNA的提取預(yù)處理。

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3樓2013-04-11 22:59:29

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馨沁

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2樓2013-04-11 21:31:08

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zhoujlhn

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2樓: Originally posted by 馨沁 at 2013-04-11 21:31:08
反復(fù)凍融一下試試吧

按照這個(gè)方法RNA到提取出了好多，DNA沒(méi)有出來(lái)

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4樓2013-04-12 09:17:53

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3樓: Originally posted by 楓林雨 at 2013-04-11 22:59:29
要進(jìn)行預(yù)備處理，去除色素，抑制性物質(zhì)等。用PBS溶液處理等，你可以參考下土壤總DNA的提取預(yù)處理。

我用PBS洗了，丙酮也洗了，就是提取不出來(lái)，只能見(jiàn)到RNA，DNA沒(méi)有看到

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5樓2013-04-12 09:18:45

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6樓2013-04-12 10:57:06

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前面不要這么處理，只要用pBS洗滌，離心8000rpm，把上清去掉，留沉淀，洗三次后用沉淀提DNA，肯定提出來(lái)

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7樓2013-04-12 16:50:57

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5樓: Originally posted by zhoujlhn at 2013-04-12 09:18:45
我用PBS洗了，丙酮也洗了，就是提取不出來(lái)，只能見(jiàn)到RNA，DNA沒(méi)有看到...

去除RNA在第二補(bǔ)加RNA酶，DNA少我建議你放大你的體系，你出發(fā)的樣本量就太少了

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8樓2013-04-12 17:22:00

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前陣子看了資料，推薦用全基因組擴(kuò)增試劑盒，自己先搜索資料看看，然后沒(méi)錢就參考著買各種試劑回來(lái)做，基本都有國(guó)產(chǎn)的。

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為什么

9樓2013-04-12 21:27:02

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既然結(jié)果里提到RNA很多，為什么步驟里沒(méi)有RNA酶的處理？

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10樓2013-04-13 16:29:54

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