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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 豬糞中細菌總DNA的提取
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zhoujlhn銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
豬糞中細菌總DNA的提取
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小弟最近在提取豬糞中細菌的總DNA，老板說要自己摸索方法，沒有考慮過用試劑盒，但是怎么提都沒有提出來，請教各位前輩，有誰做過這一塊的，請你給小弟我支支招！先謝謝了！ 下面是我用的方法：樣品的前處理： 稱取0.3g糞樣放入2ml離心管中，加入1.5mlPBS（ph8.0）溶液，旋渦振蕩混勻，4℃，800rpm離心10min;吸上清液轉入另一干凈2ml離心管中，4℃， 1000rpm離心 10min;再將上清液轉入另一干凈 2ml離心管中，重復此步驟，直至離心后上清液有菌體渾濁感為止；最后將上清液4℃，13000rpm離心5分鐘，棄上清，收集沉淀。將沉淀用適量丙酮洗滌，并轉入到 1.5ml離心管中，旋渦振蕩混勻， 4℃，13000rpm離心5分鐘，棄上清。用丙酮洗滌兩次后，收集沉淀自然干燥或吹干 細胞裂解及DNA抽提： 1、 經(jīng)過前處理后的樣品，加600μL TE，20μL溶菌酶 (100mg/ml)，輕輕顛倒混勻，于37℃放置 30min; 2、 加入15μL蛋白酶K，500μL裂解液，55℃溫浴3-4h，每 20min輕輕顛倒混勻一次; 3、 然后加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，輕輕混成乳濁液， 4℃，13000rpm離心10min，小心吸上相至空管中; 4、 再加等體積的氯仿/異戊醇(24:l)輕輕顛倒混勻，13000rpm離心 10min，小心吸上相至空管中;加等體積的異丙醇，-20℃沉淀過夜; 5、 將DNA樣品取出，13000rpm離心20min，倒去異丙醇，用80%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心 10min，棄上清，并將異丙醇吹干; 6、 將DNA溶于60μL TE，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-70℃保存. |
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 總DNA提取 |
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yaoyl0679
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