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如何鑒定一個蛋白是AKT激酶的底物
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| 想驗證AKT能否將蛋白A的ser59位點磷酸化，除了放射性實驗還有其他方法嗎？A蛋白沒有磷酸化抗體。請高手指教，不勝感激 |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物學實驗經(jīng)驗 | 蛋白質(zhì)生物學實驗經(jīng)驗 |
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3樓2013-04-21 21:14:14
凌波麗
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方法有很多，我隨便說說。 樓主“想驗證AKT能否將蛋白A的ser59位點磷酸化，除了放射性實驗還有其他方法嗎？” 問題的核心是檢測出蛋白A的ser59位點磷酸化，那么就簡單的檢測方法用質(zhì)譜檢測出磷酸化的修飾位點，你要是經(jīng)費充足，愿意用MS-MS測序也行，或者培養(yǎng)出單晶體進行X-ray diffraction，或者冷凍顯微電鏡觀測也可以。 呵呵。。。說點經(jīng)費花費少且能操作簡單的：AKT與蛋白A混合入水溶液，取AKT最適合的反應條件，加入其它底物或者反應成分，充分反應后，分離出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用質(zhì)譜測定未經(jīng)與AKT混合的天然的同一種的蛋白A，兩者對比各個肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位點是否磷酸化。 |
2樓2013-04-19 18:23:29
凌波麗
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4樓2013-04-21 21:23:48
凌波麗
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| 用于確定磷酸肽中的磷酸化位點的質(zhì)譜方法有兩種：第一種為ESI-CID，MALDI-PSD，通過磷酸脂鍵的斷裂產(chǎn)生的特征離子鑒定；第二種為檢測磷酸脂鍵基團使得肽段增加的質(zhì)量數(shù)。通常在蛋白質(zhì)磷酸化研究中的蛋白質(zhì)的序列是已經(jīng)知道的，如果不知道就用以Ediman降解為基礎的自動多肽測序儀測定可能被磷酸化的蛋白質(zhì)的序列也不是難事。因此可以通過對磷酸集團加合在Ser,Thr,Tyr殘基上的引起的80道爾頓的質(zhì)量數(shù)差的分析而檢測出蛋白質(zhì)產(chǎn)生的磷酸肽。所以通過MALDI-TOF-MS酶切指紋圖譜后，通過質(zhì)量測定值與預測值（完全沒有磷酸化）的比較可以獲得確定磷酸肽中的磷酸化位點定的確定位點。 |
5樓2013-04-21 21:41:33
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