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如何鑒定一個(gè)蛋白是AKT激酶的底物
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| 想驗(yàn)證AKT能否將蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，除了放射性實(shí)驗(yàn)還有其他方法嗎？A蛋白沒(méi)有磷酸化抗體。請(qǐng)高手指教，不勝感激 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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凌波麗
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其實(shí)也可以用簡(jiǎn)單的試驗(yàn)方法確定磷酸化位點(diǎn)，就是類似于對(duì)角線法確定二硫鍵的位點(diǎn)的方法，但是也可以不用雙向電泳。你可以先將AKT與蛋白A混合入水溶液，取AKT最適合的反應(yīng)條件，加入其它底物或者反應(yīng)成分，充分反應(yīng)后，分離出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用質(zhì)譜測(cè)定未經(jīng)與AKT混合的天然的同一種的蛋白A，兩者對(duì)比各個(gè)肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位點(diǎn)是否磷酸化。上面說(shuō)的質(zhì)譜方法可以從頭確定被磷酸化的全部氨基酸序列來(lái)確定具體的磷酸化位點(diǎn)。 但是也可以只用質(zhì)譜測(cè)定Ser,Thr,Tyr殘基所在的小肽段的質(zhì)量變化來(lái)確定磷酸微點(diǎn)�？梢袁F(xiàn)在磷酸化條件前后，用同種酶水解蛋白質(zhì)A，然后可以做個(gè)肽譜分析，就是走個(gè)一維電泳，看哪個(gè)肽段在可能的磷酸化之后發(fā)生了質(zhì)量變化，這很容易在電泳中顯示出來(lái)，兩次電泳位置發(fā)生變化的肽斑所在的凝膠塊用刀切下來(lái)，回收后以沒(méi)有磷酸化時(shí)的肽段測(cè)序，這樣即使不知道整個(gè)蛋白質(zhì)A的序列，也能測(cè)出磷酸肽上的具體磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)然要發(fā)文章，必須要知道蛋白質(zhì)A的序列，這樣才能知道磷酸化位點(diǎn)的具體位置。同時(shí)電泳本身就可以測(cè)定出各個(gè)肽段的分子量。 我把全部試驗(yàn)流程多說(shuō)出來(lái)了，不知道樓主是否聽(tīng)明白了。 |
7樓2013-04-21 22:07:05
【答案】應(yīng)助回帖
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1. 沒(méi)有特異性抗體的情況下可以用AKT substrate的泛抗體檢測(cè)，或者靠在phospho-tag膠電泳檢測(cè)遷移率改變。 2. 要說(shuō)明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。 3. 細(xì)胞培養(yǎng)液加入AKT抑制劑或者激活劑看目標(biāo)蛋白在phospho-Tag膠的遷移率的變化。 4. 做該位點(diǎn)的Ser to Ala的點(diǎn)突變，看同樣條件是否有遷移率的變化。 5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。 6. 該位點(diǎn)附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。 7. 該位點(diǎn)的磷酸化對(duì)蛋白功能的影響是否和AKT的功能相關(guān)。 8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同樣影響該位點(diǎn)磷酸化水平。。。。。。。。。 |
8樓2013-04-21 22:32:06
凌波麗
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| 用于確定磷酸肽中的磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜方法有兩種：第一種為ESI-CID，MALDI-PSD，通過(guò)磷酸脂鍵的斷裂產(chǎn)生的特征離子鑒定；第二種為檢測(cè)磷酸脂鍵基團(tuán)使得肽段增加的質(zhì)量數(shù)。通常在蛋白質(zhì)磷酸化研究中的蛋白質(zhì)的序列是已經(jīng)知道的，如果不知道就用以Ediman降解為基礎(chǔ)的自動(dòng)多肽測(cè)序儀測(cè)定可能被磷酸化的蛋白質(zhì)的序列也不是難事。因此可以通過(guò)對(duì)磷酸集團(tuán)加合在Ser,Thr,Tyr殘基上的引起的80道爾頓的質(zhì)量數(shù)差的分析而檢測(cè)出蛋白質(zhì)產(chǎn)生的磷酸肽。所以通過(guò)MALDI-TOF-MS酶切指紋圖譜后，通過(guò)質(zhì)量測(cè)定值與預(yù)測(cè)值（完全沒(méi)有磷酸化）的比較可以獲得確定磷酸肽中的磷酸化位點(diǎn)定的確定位點(diǎn)。 |
5樓2013-04-21 21:41:33
凌波麗
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myprayer: 應(yīng)助指數(shù)+1, EPI就該給予這樣的牛人。 2013-04-22 08:54:10
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補(bǔ)充一下，對(duì)于蛋白質(zhì)的點(diǎn)突變本身就是研究蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)與折疊路徑的一種實(shí)驗(yàn)方法，不要僥幸于突變了可能的重要功能位點(diǎn)的氨基酸殘基而不會(huì)引起蛋白質(zhì)整體折疊狀態(tài)的改變，何況8樓的方案還是從基因表達(dá)水平改起，這樣新生肽鏈的Ser to Ala，極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸，很難預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的折疊路徑與最終折疊會(huì)有什么樣的變化。況且，可能磷酸化的位點(diǎn)至少有Ser,Trp,Tyr,除此外可能還有His，難道要把這些氨基酸都依次突變一輪嗎？ 參見(jiàn)：Bret A.Shirley edits ,Protein Stablity and Folding----Protein and Practice,Huamana Press,1995,p271-290. |
10樓2013-04-21 23:54:24
凌波麗
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方法有很多，我隨便說(shuō)說(shuō)。 樓主“想驗(yàn)證AKT能否將蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，除了放射性實(shí)驗(yàn)還有其他方法嗎？” 問(wèn)題的核心是檢測(cè)出蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，那么就簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法用質(zhì)譜檢測(cè)出磷酸化的修飾位點(diǎn)，你要是經(jīng)費(fèi)充足，愿意用MS-MS測(cè)序也行，或者培養(yǎng)出單晶體進(jìn)行X-ray diffraction，或者冷凍顯微電鏡觀測(cè)也可以。 呵呵。。。說(shuō)點(diǎn)經(jīng)費(fèi)花費(fèi)少且能操作簡(jiǎn)單的：AKT與蛋白A混合入水溶液，取AKT最適合的反應(yīng)條件，加入其它底物或者反應(yīng)成分，充分反應(yīng)后，分離出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用質(zhì)譜測(cè)定未經(jīng)與AKT混合的天然的同一種的蛋白A，兩者對(duì)比各個(gè)肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位點(diǎn)是否磷酸化。 |
2樓2013-04-19 18:23:29
shuibingyue
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