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shuibingyue新蟲 (小有名氣)
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如何鑒定一個(gè)蛋白是AKT激酶的底物
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| 想驗(yàn)證AKT能否將蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，除了放射性實(shí)驗(yàn)還有其他方法嗎？A蛋白沒有磷酸化抗體。請(qǐng)高手指教，不勝感激 |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | 【分子生物】EPI帖 | 核酸生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) | 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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| 用于確定磷酸肽中的磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜方法有兩種：第一種為ESI-CID，MALDI-PSD，通過磷酸脂鍵的斷裂產(chǎn)生的特征離子鑒定；第二種為檢測(cè)磷酸脂鍵基團(tuán)使得肽段增加的質(zhì)量數(shù)。通常在蛋白質(zhì)磷酸化研究中的蛋白質(zhì)的序列是已經(jīng)知道的，如果不知道就用以Ediman降解為基礎(chǔ)的自動(dòng)多肽測(cè)序儀測(cè)定可能被磷酸化的蛋白質(zhì)的序列也不是難事。因此可以通過對(duì)磷酸集團(tuán)加合在Ser,Thr,Tyr殘基上的引起的80道爾頓的質(zhì)量數(shù)差的分析而檢測(cè)出蛋白質(zhì)產(chǎn)生的磷酸肽。所以通過MALDI-TOF-MS酶切指紋圖譜后，通過質(zhì)量測(cè)定值與預(yù)測(cè)值（完全沒有磷酸化）的比較可以獲得確定磷酸肽中的磷酸化位點(diǎn)定的確定位點(diǎn)。 |
5樓2013-04-21 21:41:33
凌波麗
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其實(shí)也可以用簡(jiǎn)單的試驗(yàn)方法確定磷酸化位點(diǎn)，就是類似于對(duì)角線法確定二硫鍵的位點(diǎn)的方法，但是也可以不用雙向電泳。你可以先將AKT與蛋白A混合入水溶液，取AKT最適合的反應(yīng)條件，加入其它底物或者反應(yīng)成分，充分反應(yīng)后，分離出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用質(zhì)譜測(cè)定未經(jīng)與AKT混合的天然的同一種的蛋白A，兩者對(duì)比各個(gè)肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位點(diǎn)是否磷酸化。上面說的質(zhì)譜方法可以從頭確定被磷酸化的全部氨基酸序列來確定具體的磷酸化位點(diǎn)。 但是也可以只用質(zhì)譜測(cè)定Ser,Thr,Tyr殘基所在的小肽段的質(zhì)量變化來確定磷酸微點(diǎn)�？梢袁F(xiàn)在磷酸化條件前后，用同種酶水解蛋白質(zhì)A，然后可以做個(gè)肽譜分析，就是走個(gè)一維電泳，看哪個(gè)肽段在可能的磷酸化之后發(fā)生了質(zhì)量變化，這很容易在電泳中顯示出來，兩次電泳位置發(fā)生變化的肽斑所在的凝膠塊用刀切下來，回收后以沒有磷酸化時(shí)的肽段測(cè)序，這樣即使不知道整個(gè)蛋白質(zhì)A的序列，也能測(cè)出磷酸肽上的具體磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)然要發(fā)文章，必須要知道蛋白質(zhì)A的序列，這樣才能知道磷酸化位點(diǎn)的具體位置。同時(shí)電泳本身就可以測(cè)定出各個(gè)肽段的分子量。 我把全部試驗(yàn)流程多說出來了，不知道樓主是否聽明白了。 |
7樓2013-04-21 22:07:05
凌波麗
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myprayer: 應(yīng)助指數(shù)+1, EPI就該給予這樣的牛人。 2013-04-22 08:54:10
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補(bǔ)充一下，對(duì)于蛋白質(zhì)的點(diǎn)突變本身就是研究蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)與折疊路徑的一種實(shí)驗(yàn)方法，不要僥幸于突變了可能的重要功能位點(diǎn)的氨基酸殘基而不會(huì)引起蛋白質(zhì)整體折疊狀態(tài)的改變，何況8樓的方案還是從基因表達(dá)水平改起，這樣新生肽鏈的Ser to Ala，極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸，很難預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的折疊路徑與最終折疊會(huì)有什么樣的變化。況且，可能磷酸化的位點(diǎn)至少有Ser,Trp,Tyr,除此外可能還有His，難道要把這些氨基酸都依次突變一輪嗎？ 參見：Bret A.Shirley edits ,Protein Stablity and Folding----Protein and Practice,Huamana Press,1995,p271-290. |
10樓2013-04-21 23:54:24
凌波麗
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方法有很多，我隨便說說。 樓主“想驗(yàn)證AKT能否將蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，除了放射性實(shí)驗(yàn)還有其他方法嗎？” 問題的核心是檢測(cè)出蛋白A的ser59位點(diǎn)磷酸化，那么就簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法用質(zhì)譜檢測(cè)出磷酸化的修飾位點(diǎn)，你要是經(jīng)費(fèi)充足，愿意用MS-MS測(cè)序也行，或者培養(yǎng)出單晶體進(jìn)行X-ray diffraction，或者冷凍顯微電鏡觀測(cè)也可以。 呵呵。。。說點(diǎn)經(jīng)費(fèi)花費(fèi)少且能操作簡(jiǎn)單的：AKT與蛋白A混合入水溶液，取AKT最適合的反應(yīng)條件，加入其它底物或者反應(yīng)成分，充分反應(yīng)后，分離出蛋白A，用胰蛋白酶水解后，用質(zhì)譜測(cè)定未經(jīng)與AKT混合的天然的同一種的蛋白A，兩者對(duì)比各個(gè)肽段的分子量即可知道蛋白A的ser59位點(diǎn)是否磷酸化。 |
2樓2013-04-19 18:23:29
shuibingyue
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1. 沒有特異性抗體的情況下可以用AKT substrate的泛抗體檢測(cè)，或者靠在phospho-tag膠電泳檢測(cè)遷移率改變。 2. 要說明某蛋白是bona fide的AKT底物不是做做in vitro kinase assay就可以的。 3. 細(xì)胞培養(yǎng)液加入AKT抑制劑或者激活劑看目標(biāo)蛋白在phospho-Tag膠的遷移率的變化。 4. 做該位點(diǎn)的Ser to Ala的點(diǎn)突變，看同樣條件是否有遷移率的變化。 5. 敲低AKT看是否依然存在磷酸化。 6. 該位點(diǎn)附近序列是不是保守的AKT conserved phosphorylation motif。 7. 該位點(diǎn)的磷酸化對(duì)蛋白功能的影響是否和AKT的功能相關(guān)。 8. 激活或者抑制AKT的胞外刺激是否能同樣影響該位點(diǎn)磷酸化水平。。。。。。。。。 |
8樓2013-04-21 22:32:06
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9樓2013-04-21 23:44:25
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