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lmcyjxs專家顧問
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[求助]
第一次做藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)12h后無斑
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如題，第一次做藍(lán)白斑篩選，感覺問題挺多的，中午12點(diǎn)拿去培養(yǎng)，晚上12點(diǎn)看了好像都沒長(zhǎng)，一個(gè)籃斑都沒有，白斑也沒有，有的也只是幾個(gè)氣泡，看上去像白斑而已。。。 本來昨天晚上做涂布的，但是培養(yǎng)基瓶子被人不小心弄破了，只好今天上午再做，所以含有目的片段的DH5a感受態(tài)細(xì)胞放在-20℃了一晚，用時(shí)冰上溶解再涂布的，這樣會(huì)對(duì)細(xì)菌的活性有影響嗎？ 我的IPTG（100mg/mL）、Amp（100mg/mL）及X-Gal（20mg/mL）是新配的，但是x-gal一開始我習(xí)慣性地加水來溶，發(fā)現(xiàn)不溶才頓覺自己溶劑加錯(cuò)了，然后取沉在管底的x-gal粉末加二甲基甲酰胺來溶，自己不知道這樣是不是會(huì)影響很大，但是想既然一切都準(zhǔn)備就緒了，就做了幾個(gè)平板試試看 一個(gè)對(duì)照（ddH2O 200ul ）；一個(gè)用自己新配的的X-Gal（200ul菌液涂布）；一個(gè)用以前師姐配的x-gal（不確定是否失效）200ul菌液涂布； AMp在倒板前加入，后就涂8ul IPTG，然后40ul X-Gal，最后菌液200ul，都是在酒精燈旁操作的，當(dāng)稍微傾斜培養(yǎng)基，看到培養(yǎng)基表面液體不流動(dòng)時(shí)放在37℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)。 剛看了下，都沒長(zhǎng)的樣子。。。 剛看了些帖，越發(fā)睡不著，是不是我涂菌液時(shí)來回次數(shù)多，把細(xì)胞壓死了，細(xì)胞都死了，所以長(zhǎng)不起來了？？或者我Amp（終濃度100ug/ml,可能實(shí)際濃度比這個(gè)稍大些）加了有點(diǎn)多？？還是x-Gal有問題會(huì)影響很大？難道x-Gal有問題會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)？ 求各位大俠指點(diǎn)��！ [ Last edited by lmcyjxs on 2013-5-5 at 01:20 ] |
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9樓2013-06-14 11:40:49
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你的藍(lán)白斑都沒有應(yīng)該是菌的問題。你指的是做完熱激、復(fù)蘇的菌液放在-20°C了？還是說沒做熱激前凍在-20°C了？感受態(tài)也不能反復(fù)凍融。有可能菌被凍死了吧。復(fù)蘇的感受態(tài)如果不能馬上涂板，可以放在4°C，第二天再涂還是有活性的，超過三天就不好了。 涂布也不用特別小心，只要不是特別用力，一般菌也不會(huì)被壓死。 此外，做轉(zhuǎn)化需要做好對(duì)照。藍(lán)白斑篩選需要做空載體的對(duì)照，應(yīng)該全部是藍(lán)斑，說明篩選藥品沒問題和感受態(tài)細(xì)胞有活性。還需要有負(fù)對(duì)照，就是感受態(tài)細(xì)胞不加目的DNA，涂抗性板應(yīng)該什么都不長(zhǎng)，說明感受態(tài)沒有污染，抗性板的篩選壓力足夠。 |
2樓2013-05-05 02:21:24
lmcyjxs
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謝謝cicelyzh的熱心幫助！ 我的連接液放了-20℃了一晚，做完熱激、復(fù)蘇的菌液也放在了-20°C一晚。 是不是復(fù)蘇后的感受態(tài)馬上涂布會(huì)好些��？如果凍在-20℃，是不是先在37℃保溫下為好？ 我沒做空載體對(duì)照，培養(yǎng)18h后我發(fā)現(xiàn)只長(zhǎng)白斑了，有點(diǎn)微透明的那種，有小槍頭尖那么大，有做用ddH2O涂在含抗性的培養(yǎng)基上，陰性對(duì)照什么東西都不長(zhǎng)，說明另那兩個(gè)板長(zhǎng)出來的應(yīng)該是含抗性的目的片段吧？ 怎么會(huì)不長(zhǎng)藍(lán)斑呢？我都不相信會(huì)有那么順利就給我連上轉(zhuǎn)化出來了呢！ |
3樓2013-05-06 09:42:46
cicelyzh
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4樓2013-05-07 00:42:55
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