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全長基因表達，關(guān)于酶切位點，關(guān)于ORF
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| 我拿到的基因有2700bp左右，ORF大概在500-1900這個位置。我想表達這個基因，我該如何設(shè)計上下游引物，離ORF外測多遠？還是越近越好？再弱弱的問一句：酶切位點是目的序列上本來就有還是設(shè)計引物的時候認為加上去的？ |
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您是什么意思？表達基因？完整的基因？ 若是完整的基因，當然是整個ORF全長啦。從ATG到終止密碼子這全部。就卡這一段，堿基必須一個不多一個不少。 在這，您這酶切位點是用來干嘛的？若是為以后連載體用的，就是在加在引物的5‘端之前。具體的方法你找找酶切引物設(shè)計方面的資料，上面肯定很詳細的介紹如何設(shè)計。別忘了加保護堿基。。。  |
2樓2013-05-09 23:10:19
zhaolf
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4樓2013-05-10 10:35:49
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5樓2013-05-10 11:12:00
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1.這樣子的話我就直接選ORF兩端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位點是嗎？ 是的。 2.要是引物質(zhì)量不好不能P出ORF呢？ 引物可以稍微設(shè)計長一點，應(yīng)該沒有問題。 3.還有我在引物兩端添加酶切位點，產(chǎn)物就會有該酶切位點嗎？ 是的，酶切位點就自動加在PCR產(chǎn)物上了。 4.我只需找出ORF里面有的酶切位點，避開他們，直接在引物5端添加上酶切位點就可以了嗎？ 是的。酶切位點兩側(cè)再加2-3個保護堿基，比如CG.這樣可以提高PCR產(chǎn)物的酶切效率。載體和PCR產(chǎn)物都酶切過后就可以做連接了。 |
6樓2013-05-10 13:33:35
7樓2013-05-14 10:58:54
8樓2013-05-14 11:02:09
zhaolf
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是的，你應(yīng)該聽這個老師的。因為我做的都是只需要在細菌里表達，是不需要這段序列的，但是別的情況是有需要的。我以前用gateway 系統(tǒng)的時候手冊里有提到：Inclusion of the Shine-Dalgarno and Kozak consensus sequence allows protein expression in both E. coli and mammalian cells. 另外也要看你表達的載體是怎樣的。具體情況具體分析。 |
9樓2013-05-15 02:52:52
10樓2013-05-15 08:35:23
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