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崔永霞

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[交流] 如和鑒定一個(gè)擴(kuò)增出的序列是不是全長(zhǎng)序列？

請(qǐng)問(wèn)各位前輩，我用一個(gè)酶的全場(chǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)的引物，產(chǎn)物預(yù)計(jì)大小是1200bp，我以DNA為模板擴(kuò)增出的產(chǎn)物大于1200bp是什么原因�。�

還有就是如何檢測(cè)這個(gè)片段是不是全長(zhǎng)？如果不是全長(zhǎng)，是否可以以這個(gè)片段為模板做RACE擴(kuò)增全長(zhǎng)呢？

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1樓 2013-05-15 19:59:05

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崔永霞

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補(bǔ)充一下，我是跨這個(gè)酶的cDNA序列的起始密碼子和終止密碼子設(shè)計(jì)的引物。

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2樓2013-05-15 20:00:42

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bullfrog325

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第一個(gè)問(wèn)題, 可能這個(gè)基因沒(méi)有內(nèi)含子.
第二個(gè)問(wèn)題, 你需要做5' 和 3' RACE.

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3樓2013-05-15 20:18:25

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崔永霞

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引用回帖:

3樓: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-15 20:18:25
第一個(gè)問(wèn)題, 可能這個(gè)基因沒(méi)有內(nèi)含子.
第二個(gè)問(wèn)題, 你需要做5' 和 3' RACE.

如果沒(méi)有內(nèi)含子的話，那應(yīng)該是擴(kuò)出的片段大小不應(yīng)該大于1200bp吧？
還有就是關(guān)于RACE技術(shù)，不是應(yīng)該是以RNA為模板擴(kuò)增出cDNA第一鏈，然后以第一鏈為模板設(shè)計(jì)引物來(lái)做3‘RACE和5'RACE擴(kuò)增全長(zhǎng)嗎？可是我是根據(jù)這個(gè)酶的全長(zhǎng)cDNA來(lái)設(shè)計(jì)引物，然后擴(kuò)增出的這個(gè)DNA片段，這樣的話也可以用RACEA嗎？

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4樓2013-05-16 10:44:59

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
崔永霞(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-05-16 16:59:31

汗一個(gè), 對(duì)不住啊, 第一個(gè)問(wèn)題看走眼了, 沒(méi)有注意到"大于"....這樣的話你要看看產(chǎn)物和基因組DNA的長(zhǎng)度比較怎么樣, 在這個(gè)基因有注釋內(nèi)含子的情況下, 如你的產(chǎn)物等于或者大于基因組DNA大小, 你就需要查污染(基因組DNA污染); 如果你的PCR產(chǎn)物大小是介于1200bp和基因組DNA大小的, 很有可能擴(kuò)出來(lái)的是一個(gè)選擇性剪切產(chǎn)物. 另外也檢查一下引物的特異性, 防止別擴(kuò)出來(lái)的是其他的東西.
至RACE, 你需要用做翻轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板, 不能用已經(jīng)擴(kuò)出的那個(gè)大于1200bp的PCR, 因?yàn)閮深^的序列已經(jīng)被設(shè)計(jì)的引物限制住了.

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5樓2013-05-16 16:06:13

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