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jiangyinshen木蟲 (著名寫手)
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[求助]
siRNA轉染效率 已有2人參與
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請教各位大神，敝人從上海吉瑪訂的siRNA（A套餐），其中包括NC-FAM，于是這幾天按照invitrogen的protocol做了轉染，但是轉染24h和48h均未觀察到熒光，視野下一片漆黑，什么都沒有，不知道是什么原因，百思不得其解！ 轉染過程嚴格避光，不存在猝滅問題，我將siRNA貯存液（20umol）滴到載片上置于熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光非常強烈，說明試劑有效，但是我就是想不通為什么轉染48h還沒有一點熒光，求各路高手解答，謝謝！ 附我的轉染步驟：我做的是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，種在6孔板，細胞均勻分布，接種24h之內(nèi)細胞密度達到70%左右做的轉染。（1）轉染前30min按1.5ml/孔給細胞換液，放回孵箱；（2）每孔250ul無血清培養(yǎng)基溶解5ul siRNA，輕柔混勻，室溫靜置5min；（3）每孔250ul無血清培養(yǎng)基溶解10ul Lipofectamin2000，輕柔混勻，室溫靜置5min；（4）將充分溶解的siRNA和Lipofectamin2000混合，輕柔混勻，室溫靜置20min；（5）將上述混合物加入孔板中，完成轉染。轉染后6h用完全培養(yǎng)基換液。轉染后24h、48h、72h和96h分別收取細胞沉淀，NC-FAM組在熒光顯微鏡下觀察，檢測轉染效率。 [ 來自小組 生物醫(yī)藥家族 ] |
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4樓2013-05-19 11:02:58
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6樓2013-05-20 23:36:06
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9樓2013-07-17 20:54:27
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1.Lipofectamin2000已經(jīng)是個很古老的東西了，siRNA轉染建議你用Life的RNAi MAx轉染試劑，這個效率是大家公認的，關于國產(chǎn)的siRNA轉染試劑，我不想說太多，勸大家不要去嘗試，這個不是從洋媚外，差距是真實存在的； 2.Fam-NC是看轉染效率的，因為fam是化學合成的熒光基團，曝光太久會淬滅的，所以保存的是棕色的管子，培養(yǎng)箱也要避光，必須是6小時換液的時候看，如果樓主要看看是淬滅了還是沒轉染進去，你可以在換液前看一下熒光，如果有熒光就證明沒有淬滅，換液后熒光要是沒有了那就是沒轉染進去呀，這個道理大家懂吧； 3.關于siRNA套裝，強烈像大家推薦Transheep的siRNA套裝，性價比超高，4個靶點的套裝比其他公司3個的優(yōu)惠，還有禮品送，大家可以去訂購一下試試！ |
10樓2015-05-04 01:02:07
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