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jiangyinshen木蟲 (著名寫手)
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[求助]
siRNA轉(zhuǎn)染效率 已有2人參與
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請教各位大神，敝人從上海吉瑪訂的siRNA（A套餐），其中包括NC-FAM，于是這幾天按照invitrogen的protocol做了轉(zhuǎn)染，但是轉(zhuǎn)染24h和48h均未觀察到熒光，視野下一片漆黑，什么都沒有，不知道是什么原因，百思不得其解！ 轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格避光，不存在猝滅問題，我將siRNA貯存液（20umol）滴到載片上置于熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光非常強(qiáng)烈，說明試劑有效，但是我就是想不通為什么轉(zhuǎn)染48h還沒有一點(diǎn)熒光，求各路高手解答，謝謝！ 附我的轉(zhuǎn)染步驟：我做的是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，種在6孔板，細(xì)胞均勻分布，接種24h之內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右做的轉(zhuǎn)染。（1）轉(zhuǎn)染前30min按1.5ml/孔給細(xì)胞換液，放回孵箱；（2）每孔250ul無血清培養(yǎng)基溶解5ul siRNA，輕柔混勻，室溫靜置5min；（3）每孔250ul無血清培養(yǎng)基溶解10ul Lipofectamin2000，輕柔混勻，室溫靜置5min；（4）將充分溶解的siRNA和Lipofectamin2000混合，輕柔混勻，室溫靜置20min；（5）將上述混合物加入孔板中，完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6h用完全培養(yǎng)基換液。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h分別收取細(xì)胞沉淀，NC-FAM組在熒光顯微鏡下觀察，檢測轉(zhuǎn)染效率。 [ 來自小組 生物醫(yī)藥家族 ] |
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jiangyinshen
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jiangyinshen: 金幣+2, ★有幫助 2013-05-18 19:53:33
| 我和你做的差不多，不過是6小時(shí)換液的時(shí)候就觀察熒光，到?jīng)]有等到24小時(shí)�？梢钥吹玫睫D(zhuǎn)進(jìn)去了。要不你6小時(shí)換液的時(shí)候看看有沒有熒光。有可能換液啊之內(nèi)的操作的時(shí)候猝滅了。但是按道理24小時(shí)也可以看得到的。盡量減少lipo2000的劇烈操作 |
2樓2013-05-17 13:30:25
dongxie1982
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5樓2013-05-19 12:31:24
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