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yvonne_mi

木蟲 (正式寫手)

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[求助] 求助分離純化方法

本人做的是放線菌發(fā)酵液胞外多糖的提取和分離純化，試驗流程是這樣的：用黃豆培養(yǎng)基得到的發(fā)酵液上清減壓濃縮，乙醇醇沉，分別得到上清1和沉淀1，乙醇醇沉完的上清液1再次甲醇醇沉，分別得上清2和沉淀2.
小老板之前做的是沉淀1中的多糖的提取，我也做過，做到后來發(fā)現(xiàn)沒有活性，就沒往后做。后來發(fā)現(xiàn)甲醇醇沉的沉淀2有活性。硫酸苯酚檢測有糖的顏色反應(yīng)，懷疑有一種低聚糖（分子量在1500以下），所以開始做的它的分離純化。
目前做過各種方法純化，DEAE-52，凝膠，陰陽離子交換樹脂，大孔樹脂，都沒得到理想的結(jié)果。我的粗品易溶于水，不溶于丙酮和乙酸乙酯。而且拿凝膠收到的一部分不是很純的組分點了硅膠G板在紫外365nm下中間是暗斑，只有最外面的邊是熒光的，不知道怎么回事，是不純的原因？同時也做了三氟乙酸的酸水解，發(fā)現(xiàn)120度12h很難水解，但是從液相上分析還是出現(xiàn)了一部分葡萄糖，另外就是我的那個組分峰和組分旁邊的一個峰(懷疑是葡萄糖水解后留下來的那部分)。
在這里最困擾我的是培養(yǎng)基里的鹽組分，總會干擾我樣品的液相分析。因為用到的是海水晶，所以不知道會是什么鹽最后在我的粗品里，而且由于樣品分子量不大除鹽很困難。因為剛開始接觸分離純化，不知道怎么解決，所以想請教一下這方面的高手，有什么比較好的方法來分離純化出我想要的組分.

回復(fù)此樓

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1樓 2013-05-17 09:49:18

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分離高手

新蟲 (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
xiaoxiao270: 金幣+1 2013-05-18 18:41:43
yvonne_mi(豆哥代發(fā)): 金幣+8, 謝謝 2013-05-29 14:46:32

感覺你蘿莉啰唆的做這么多試驗，沒有多少搞到正點上去啊。首先你開始處理樣品就有問題，減壓濃縮發(fā)酵液上清，并且是放線菌的發(fā)酵上清，溫度多少啊，你的東西是不是會失去活性啊。你沒有講到你的活性是哪方面的活性，也不能給你建議是哪類物質(zhì)了。根據(jù)你的描述感覺像是糖肽類的。
我給你兩個實驗思路看看行不行：
1、發(fā)酵液，微濾除菌體，5000分子量超濾除掉大分子蛋白（假設(shè)你的物質(zhì)分子量在1500以下），納濾收集活性物質(zhì)。丙酮析晶兩次看看純度和活性。
2、發(fā)酵液微濾除菌體，HZ816吸附，SKI-20-4300離子交換層析介質(zhì)分離純化，納濾除鹽，丙酮析晶。
這樣應(yīng)該差不多了，感覺。先做下試驗試試吧

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回復(fù)此樓

2樓2013-05-18 13:30:28