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appletree-新蟲 (小有名氣)
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包涵體復(fù)性試劑盒
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| 最近在大腸桿菌中表達(dá)目的基因，優(yōu)化了好多次，可表達(dá)的幾乎都是包涵體，于是我決定包涵體復(fù)性，請問大家用過什么包涵體復(fù)性試劑盒？我看網(wǎng)上有賣生工的，不知道好用不？有包涵體復(fù)性的步驟嗎？感激不盡！ |
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不轉(zhuǎn)錄的DNA
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5樓2013-05-18 15:29:31
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【答案】應(yīng)助回帖
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樓主，你好 我沒用過什么其他家生產(chǎn)的蛋白 renaturation的試劑盒，我的蛋白refolding buffer都是我足跡配置的！ 我給你回答最后一個問題吧！ 蛋白復(fù)性是一門比較難的學(xué)問，很難講清楚！如果要長篇大論，我最起碼可以寫個8000字的綜述····每個蛋白他的renaturation方法是不同的！我暫時還沒有發(fā)現(xiàn)一個萬能的buffer來用于蛋白的復(fù)性！普通蛋白還好點，cytokines就比較難了！好了，長話短說，簡單介紹下吧： 1. 在你復(fù)性之前，你要先了解你蛋白的物理性質(zhì)和生化性質(zhì)，可以通過專門軟件和專業(yè)網(wǎng)站，例如DNAman 和NCBI。 2.根據(jù)你的protein pI值，來選擇合適的緩沖體系，Tris，PBS，或者HEPES等 3.可以通過添加一些鹽來增加蛋白的溶解性，例如NaCl；也可以通過添加一些抑制劑來增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性，如EDTA,PMSF等 4.適當(dāng)?shù)奶砑覣rg可以又利于蛋白的refolding，最好在0.4~0.8之間選擇，這期間復(fù)性的protein是有活性的。 5.也可以通過添加低濃度的變性劑來提高蛋白的復(fù)性，Urea<2M，Gin-Hcl<0.8M 6.如果你的蛋白中含有二硫鍵，要加入氧化還原系統(tǒng)來refolding！如GSH和GSSG，半胱氨酸和胱氨酸等，一般比例為10:1. 7.去垢劑的加入，有利于膜蛋白的refolding，關(guān)鍵在于去垢劑種類的選擇：離子型還是非離子型的呢？ 8. 復(fù)性時間的長短。一般變性劑在攪拌的情況下3~4h就能透析掉，如果在這個時候不沉淀，你就放心大膽的復(fù)性吧！最好復(fù)性一天（24h）！當(dāng)然不排除意外��！  9.復(fù)性最好是逐步降低你的變性劑濃度，可以更好與你的renaturation，避免蛋白發(fā)生aggregation，從而沉淀！ 10.在你將你的protein 復(fù)性之前，先要做個復(fù)性小試！取少量的蛋白復(fù)性試試，離心觀察是否有沉淀！沒有，你就可以放心大膽的做了！不排除小試不沉，大量的就沉。這種情況很少！希望你不那么倒霉��！  好吧，就這么多吧！我去吃飯了！都大了快一個小時了！ |
2樓2013-05-18 12:48:56
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3樓2013-05-18 14:35:07
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4樓2013-05-18 14:36:08
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