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崔t-o-p新蟲 (初入文壇)
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[求助]
緊急求助！220KDa蛋白純化。。。
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我要做一個(gè)細(xì)菌完整毒力基因的原核表達(dá)，基因全長6087bp，連在PET32a上，測序都正確，且表達(dá)為包涵體形式。用普通的鎳柱純化，有雜帶也就算了，我純化下來的目的蛋白僅有一條細(xì)細(xì)的線。。。根本不能進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。 參考其他大家的純化方法多掛了好幾次柱子，咪唑濃度梯度洗脫，效果都不佳，希望大家?guī)蛶兔�。。極度崩潰中。。。 |
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2樓2013-03-12 09:00:03
srwangws
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崔t-o-p: 金幣+1, ★有幫助 2013-03-12 10:36:28
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我不知道你的目的是啥，如果做的與這個(gè)蛋白的功能相關(guān)建議立馬換載體重新構(gòu)建，在native下純化。因?yàn)榫桶w而言，純化時(shí)很簡單的，復(fù)性是相對較難的，你現(xiàn)在純化出來的量就這么少，復(fù)性加復(fù)性緩沖液，摸索條件等等，你會非常吃力的。 如果你這是想做他的抗體之類的，對他的三維要求弱點(diǎn)，你可以：1.換載體，誘導(dǎo)高表達(dá)的包涵體，你載體構(gòu)建肯定過關(guān)了，對你很容易，咨詢你的同學(xué)老師找個(gè)能讓目的蛋白表達(dá)量高的載體先行構(gòu)建，以防發(fā)現(xiàn)不換載體會嚴(yán)重影響你的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.先行裂解細(xì)菌，除掉上清，變性溶解包涵體時(shí)所加變性液體積降低以增大目的蛋白在溶液中的濃度。3.根據(jù)試劑盒上問題提醒或直接咨詢他們技術(shù)部。4.將洗脫液體積降低，堵住柱子流出端，讓洗脫液與膠混勻一段時(shí)間充分洗脫后收集。4.洗脫時(shí)是有洗脫峰的，用50ul或100ul洗脫/次，然后跑膠查看洗脫峰在哪里（也可以用考馬斯亮藍(lán)G-250快速檢測），后面大量純化時(shí)只收集洗脫峰處液體，提醒：千萬不要讓膠干掉！ |
6樓2013-03-12 10:00:37
崔t-o-p
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7樓2013-03-12 10:43:07
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8樓2013-03-12 17:03:57
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9樓2013-03-12 17:33:21
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