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崔t-o-p新蟲 (初入文壇)
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[求助]
緊急求助！220KDa蛋白純化。。。
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我要做一個細菌完整毒力基因的原核表達，基因全長6087bp，連在PET32a上，測序都正確，且表達為包涵體形式。用普通的鎳柱純化，有雜帶也就算了，我純化下來的目的蛋白僅有一條細細的線。。。根本不能進行后續(xù)的試驗。 參考其他大家的純化方法多掛了好幾次柱子，咪唑濃度梯度洗脫，效果都不佳，希望大家?guī)蛶兔Α�。極度崩潰中。。。 |
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2樓2013-03-12 09:00:03
srwangws
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3樓2013-03-12 09:15:29
崔t-o-p
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4樓2013-03-12 09:32:48
5樓2013-03-12 09:51:01
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【答案】應助回帖
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崔t-o-p: 金幣+1, ★有幫助 2013-03-12 10:36:28
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我不知道你的目的是啥，如果做的與這個蛋白的功能相關建議立馬換載體重新構建，在native下純化。因為就包涵體而言，純化時很簡單的，復性是相對較難的，你現(xiàn)在純化出來的量就這么少，復性加復性緩沖液，摸索條件等等，你會非常吃力的。 如果你這是想做他的抗體之類的，對他的三維要求弱點，你可以：1.換載體，誘導高表達的包涵體，你載體構建肯定過關了，對你很容易，咨詢你的同學老師找個能讓目的蛋白表達量高的載體先行構建，以防發(fā)現(xiàn)不換載體會嚴重影響你的后續(xù)實驗。2.先行裂解細菌，除掉上清，變性溶解包涵體時所加變性液體積降低以增大目的蛋白在溶液中的濃度。3.根據(jù)試劑盒上問題提醒或直接咨詢他們技術部。4.將洗脫液體積降低，堵住柱子流出端，讓洗脫液與膠混勻一段時間充分洗脫后收集。4.洗脫時是有洗脫峰的，用50ul或100ul洗脫/次，然后跑膠查看洗脫峰在哪里（也可以用考馬斯亮藍G-250快速檢測），后面大量純化時只收集洗脫峰處液體，提醒：千萬不要讓膠干掉！ |
6樓2013-03-12 10:00:37
崔t-o-p
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7樓2013-03-12 10:43:07
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8樓2013-03-12 17:03:57
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9樓2013-03-12 17:33:21
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