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哈皮果果金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求真菌菌懸液制作方法
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| 立枯絲核菌除產(chǎn)生厚垣孢子外部產(chǎn)生其他孢子，那我如何制作菌懸液呢？順便再問(wèn)一下，菌懸液和菌絲懸浮液一樣嗎？如果用于給植物體接種的話(huà)應(yīng)該用誰(shuí)呢？謝謝大家~急急急�。。� |
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【答案】應(yīng)助回帖
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不知何菌~~~ 真菌菌懸液的制備 1）白色念珠菌懸液的制備 1）取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開(kāi)，以毛細(xì)吸管吸加適量沙堡液體培養(yǎng)基于管中，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液體培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37℃培養(yǎng) 18h～24h。用接種環(huán)取第 1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線(xiàn)接種于沙堡瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于沙堡瓊脂斜面，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h，即為第 3 代培養(yǎng)物。 2）取第3代～14代的沙堡瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用電動(dòng)混合器混合20s，或在手掌上振敲 80次，以使白色念珠菌菌懸浮均勻。 3）菌懸液的含菌量和菌片制備按2.1.1.2 要求進(jìn)行。 4）菌懸液保存在 4℃ 冰箱內(nèi)備用。當(dāng)天使用不得過(guò)夜。 5）懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。菌落形態(tài)可直接用顯微鏡觀(guān)察。菌體形態(tài)可在涂片后直接用高倍顯微鏡觀(guān)察，也可用墨水陰地法染色（將菌與黑墨水在玻片上混勻，推成薄膜）后觀(guān)察。 （2） 黑曲霉ATCC 16404 懸液或菌片的制備。 1) 在無(wú)菌操作下打開(kāi)凍干菌種管，以毛細(xì)管吸取少量麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基加到菌種管中，輕輕吹吸，使菌種沉淀物融化分散。取少許沉淀物懸液加到含 5.0ml 麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，置 30℃±1℃ 培養(yǎng) 42h～48h。用接種環(huán)劃線(xiàn)接種第 1 代培養(yǎng)物于 MEA 培養(yǎng)基平板，置 30℃±1℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 42h～48h。取平板培養(yǎng)物中的典型菌落，接種于麥芽浸膏營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，置 30℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 42h～48h，即為第3代培養(yǎng)物。 2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培養(yǎng)物，接種羅氏瓶，并搖動(dòng)使菌液布滿(mǎn) MEA 培養(yǎng)基表面，然后將多余肉湯培養(yǎng)物液體吸出，置 30℃±1℃ 培養(yǎng) 42h～48h。 3) 向羅氏瓶培養(yǎng)物中加入5.0 ml～10.0ml 0.05%（V/V）吐溫 80 生理鹽水溶液, 刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕振搖 1min 后,濾過(guò)除去菌絲。濾過(guò)后，顯微鏡下（400 倍）觀(guān)察是否存在菌絲，若懸液中有菌絲存在，可經(jīng) 5000 r/min～6000 r/min，離心 20min。再次在顯微鏡下（400 倍）觀(guān)察，若懸液中仍有菌絲存在，須再離心。 4) 黑曲霉分生孢子懸液在 2℃～8℃ 儲(chǔ)存不能超過(guò) 2 d，使用前，混合均勻，在顯微鏡下（400 倍）觀(guān)察是否有孢子出芽，若有孢子出芽，則棄之不用。 5) 使用時(shí)，可用稀釋液適當(dāng)稀釋。 6) 制備染菌樣片時(shí)染菌方法為滴染法,每片加菌懸液10μl。染菌后，置 37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)烤干(約 30min)，或置室溫下自然陰干后再使用。 7) 回收菌數(shù)應(yīng)達(dá)5×`10^5`cfu/片～5×`10^6`cfu/片，可依試驗(yàn)要求確定。 生孢梭菌菌懸液制備 其實(shí)無(wú)菌方法驗(yàn)證中的菌懸液的制備也是依中國(guó)藥典（2005年版二部）附錄XI H無(wú)菌檢查法中“培養(yǎng)基靈敏度檢查”項(xiàng)下的方法，制備成小于100 CFU/ml的對(duì)照用菌液。所以無(wú)論你做什么，菌懸液的制備方法都是一樣的。 具體方法就是，先把生孢梭菌在硫乙醇中培養(yǎng)24小時(shí)，然后吸取1毫升培養(yǎng)液用生理鹽水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)业慕?jīng)驗(yàn)是，稀釋到10的-7次方就是在100cfu以下了（這個(gè)你得自己多做幾次平行實(shí)驗(yàn)或驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，看到底稀釋到多少倍。最初不好把握的時(shí)候可以同時(shí)培養(yǎng)幾個(gè)臨近的梯度），然后取至少200ml的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基到試管里（要求無(wú)菌），然后接種1ml制備好的菌懸液到硫乙醇試管里，在32.5度下培養(yǎng)18h，然后開(kāi)始計(jì)數(shù)。 生孢梭菌在液體的硫乙醇里會(huì)長(zhǎng)成梭子一樣的單個(gè)菌落，這時(shí)拿的時(shí)候千萬(wàn)不要震動(dòng)，然后開(kāi)始計(jì)數(shù)（一個(gè)單獨(dú)的“梭子”計(jì)一個(gè)菌落）。 如果培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生渾濁，不便于計(jì)數(shù)。如果震動(dòng)試管也會(huì)渾濁。硫乙醇的量盡量大一點(diǎn)，這樣便于計(jì)數(shù)。 |
4樓2013-05-23 23:29:37
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