 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2427 | 回復(fù): 13 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[求助]
DGGE 垂直電泳 灌膠技術(shù) 各位大俠幫幫忙
|
|||
|
想確定變性劑的梯度范圍，請(qǐng)問(wèn)DGGE垂直電泳的膠是怎么灌的呢，梯度變化是水平的，那怎么灌呢�？戳艘粋�(gè)文獻(xiàn)貌似說(shuō)也是用伯樂(lè)的小車(chē)，一管高，一管低，那梯度是怎么形成的呢。那和我們平時(shí)跑得正常的DGGE 也就是水平的DGGE 灌膠不就是用小車(chē)灌的嗎？ 第二個(gè)是我每次灌膠拔完梳子之后兩邊的空挺平的，可是中間的膠孔就會(huì)晚上拱形成一個(gè)弧度，那在這樣的孔里加樣跑出來(lái)的條帶都不直，還有做膠是空附近還總是有氣泡。 大家看看我這圖，我總感覺(jué)條帶沒(méi)分開(kāi)，是電泳時(shí)間影響還是變性劑的梯度范圍 我的條件是180v,6h，變性劑30-60%,上樣量25ul。 MARKER也會(huì)變性，怎么標(biāo)注呢。 新手問(wèn)問(wèn)大家有沒(méi)有什么小技巧或注意事項(xiàng)。請(qǐng)大家賜教謝謝 1.JPG |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 有價(jià)值的生物經(jīng)驗(yàn)貼 |
» 猜你喜歡
材料調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
081700 調(diào)劑 267分
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
請(qǐng)教下大家 2026年國(guó)家基金申請(qǐng)是雙盲審嗎？
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
276求調(diào)劑。有半年電池和半年高分子實(shí)習(xí)經(jīng)歷
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
一志愿南航材料專(zhuān)317分求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
生物學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
284求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
一志愿山東大學(xué)藥學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
07化學(xué)280分求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 緊急求助：DGGE跑電泳時(shí)，為什么樣品（pcr產(chǎn)物）始終集中在點(diǎn)樣孔，跑不下去？
已經(jīng)有12人回復(fù)
- DGGE電泳問(wèn)題交流
已經(jīng)有6人回復(fù)
- DGGE實(shí)驗(yàn)中上樣緩沖液（loading dye ）和普通瓊脂糖電泳用的6*loding buffer一樣嗎？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 變形梯度凝膠電泳PCR-DGGE
已經(jīng)有68人回復(fù)
- DGGE電泳高手請(qǐng)進(jìn)，看看這個(gè)30%-60%的膠梯度合理不？有圖求真相！�。�
已經(jīng)有14人回復(fù)
- DGGE膠濃度有問(wèn)題，
已經(jīng)有4人回復(fù)
- Matlab 實(shí)現(xiàn)DGGE電泳圖譜的 泳道多樣性指數(shù)，相似性指數(shù)，泳道聚類(lèi)分析
已經(jīng)有26人回復(fù)
- 大家?guī)兔匆幌?6S-V3區(qū)擴(kuò)增的電泳圖嘛（有關(guān)DGGE）
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 如何用quantity one對(duì)DGGE電泳條帶進(jìn)行數(shù)字化
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 求助-TGGE和DGGE的電泳圖譜
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 用Quantity one分析DGGE電泳結(jié)果，如果計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)
已經(jīng)有11人回復(fù)
- DGGE電泳為什么要預(yù)熱電泳緩沖液到60度？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- DGGE預(yù)電泳問(wèn)題
已經(jīng)有11人回復(fù)
- DGGE電泳的問(wèn)題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教關(guān)于PCR-DGGE的問(wèn)題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于DGGE電泳儀的改裝
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)教DGGE電泳圖
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于變性梯度凝膠電泳(DGGE)
已經(jīng)有17人回復(fù)
7樓2013-05-26 16:21:56
志子
至尊木蟲(chóng) (文壇精英)
- MicEPI: 5
- 應(yīng)助: 2847 (講師)
- 貴賓: 0.743
- 金幣: 42456.9
- 散金: 3857
- 紅花: 299
- 帖子: 21362
- 在線: 1136.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 2471022
- 注冊(cè): 2013-05-19
- 專(zhuān)業(yè): 高分子組裝與超分子結(jié)構(gòu)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mandywang: 金幣+15, ★★★很有幫助 2013-05-26 16:01:26
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mandywang: 金幣+15, ★★★很有幫助 2013-05-26 16:01:26
|
制備平行膠： 平行膠中從上至下變性劑的濃度遞增。這種膠適用于分析大量樣品。 1) 與制備標(biāo)準(zhǔn)聚丙烯胺凝膠一樣制備膠板。 2) 從丙烯酰胺和兩種變性劑貯存液中取兩份等體積溶液以符合要求的變性劑濃度范圍。溶液的總體積一般為剛好覆蓋膠板。丙烯酰胺的濃度取決于DNA 片段的大小，對(duì)于DNA 片段大小為≥300bp 的丙烯酰胺的濃度為6%， 而長(zhǎng)度＜300bp 的DNA 片段，丙烯酰胺的濃度為12%。 3) 加高濃度變性劑溶液到梯度生成器右槽中(該溶液將首先通過(guò)梯度合成器進(jìn)入膠板間的空隙)，打開(kāi)連接梯度生成器兩端的開(kāi)關(guān)，讓一些溶液流入左槽內(nèi)關(guān)上開(kāi)關(guān)，用吸管把它們移回到右槽(目的是確保兩槽之間無(wú)氣泡的阻隔)。然后把低濃度變性劑溶液加到梯度生成器左槽中。 4) 攪拌這兩個(gè)槽中溶液的同時(shí)向其中加入4.5μL/mLl0%的過(guò)硫酸銨和1μL/mL 的TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。 5) 輕輕打開(kāi)兩槽之間的開(kāi)關(guān)及梯度生成器出口的開(kāi)關(guān)，灌膠時(shí)兩槽內(nèi)的溶液應(yīng)處于攪拌狀態(tài)(尤其高濃度溶液槽應(yīng)攪拌)，溶液受重力影響通過(guò)一個(gè)放在兩塊玻璃板之間的頂部的細(xì)塑料管流過(guò)梯度生成器。流速應(yīng)保持一定大小以保證溶液在凝聚之前所有溶液都應(yīng)注入到兩層玻璃板之間。(凝聚速度可通過(guò)調(diào)整過(guò)硫酸銨和TEMED 的濃度來(lái)調(diào)節(jié))。 6) 膠板充滿后，在其頂部插入梳子并將其放平，凝聚至少30min。(膠可事先灌好并于4℃貯存幾天)。 制備垂直膠 垂直膠含有丙烯酰胺的濃度是固定的，垂直于電泳方向有一個(gè)線性遞增的變性劑梯度。這種膠適用于確定分離含有核苷酸改變的DNA 片段的最佳梯度范圍。垂直膠的制備大體相似和平行膠的制備，但也有所不同： 1) 像標(biāo)準(zhǔn)的聚丙烯酰胺凝膠一樣制備膠板，但其頂部不插入梳子。 2) 準(zhǔn)備一塊比梳子稍短的涂上潤(rùn)滑劑的間隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，這樣左邊就留下一個(gè)缺口。用夾子夾緊這一邊。把膠板旋轉(zhuǎn)90°這樣和缺口相連的這一面就轉(zhuǎn)到最上面了。膠液將通過(guò)該缺口進(jìn)入兩玻璃板之間。如前所述的方法灌膠。 3) 膠完全凝固之后，將膠板垂直立起，輕輕移出膠頂部的間隔片。膠的頂部就會(huì)出現(xiàn)大而平的孔，這樣就可以進(jìn)行電泳了。 注意： 在混合和灌膠時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。 有時(shí)聚丙烯酰胺凝膠的左側(cè)會(huì)出現(xiàn)縮水現(xiàn)象以致在膠的頂部到底部之間會(huì)產(chǎn)生空氣通道，可用2%熔化的瓊脂糖凝膠將其充滿。 所有溶液應(yīng)保存于4℃棕色瓶中，一般幾個(gè)月到一年內(nèi)有效。 電泳時(shí)凝膠溫度必須保持恒定，要達(dá)到這一要求，可把膠板浸沒(méi)于充分?jǐn)嚢璧臏乜鼐彌_液槽內(nèi)。對(duì)于缺乏變性劑時(shí)比較容易變性的DNA 來(lái)說(shuō)，槽內(nèi)的溫度選擇在60℃稍微超過(guò)熔點(diǎn)，并且大部分的工作都在60℃下進(jìn)行(但溫度稍高或低一點(diǎn)都可采用)。溫度保持恒定可將電泳緩沖液加熱到60℃，并把膠浸入其中進(jìn)行電泳即可。 |
2樓2013-05-26 01:59:33
3樓2013-05-26 16:01:03
老夏853
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- MicEPI: 2
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 金幣: 5944.8
- 散金: 1705
- 紅花: 17
- 帖子: 2076
- 在線: 1230.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 463482
- 注冊(cè): 2007-11-20
- 專(zhuān)業(yè): 食品加工技術(shù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mandywang: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-05-26 16:07:22
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
mandywang: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-05-26 16:07:22
|
首先確定好 變性劑梯度范圍正確的話 建議吧 膠濃度 提高一個(gè)梯度。比如 通常8%的膠 用來(lái)跑300 左右的片段 提高到10% 或者更高一點(diǎn)， 這樣再去摸索電泳時(shí)間和電壓組合 通常出來(lái)的條帶會(huì)分的比較開(kāi) 而且形狀也漂亮。 這張圖 做的還不錯(cuò)。不過(guò)條帶有點(diǎn)糊 。 要用去離子鍵酰胺 和 去離子水，而且過(guò)硫酸銨溶液最好現(xiàn)配 。 瓶子 器皿啥玩意要刷洗干凈。 細(xì)節(jié) 決定成敗 。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
mandywang4樓2013-05-26 16:01:21
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿山東大學(xué)藥學(xué)學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | 開(kāi)開(kāi)心心沒(méi)煩惱 2026-03-23 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料/農(nóng)業(yè)專(zhuān)業(yè)，07/08開(kāi)頭均可，過(guò)線就行 +3 | 呵唔哦豁 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 361求調(diào)劑 +3 | Glack 2026-03-22 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿211 初試270分 求調(diào)劑 +4 | 谷雨上岸 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 298求調(diào)劑 +8 | 上岸6666@ 2026-03-20 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 308求調(diào)劑 +3 | 墨墨漠 2026-03-21 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 319求調(diào)劑 +4 | 小力氣珂珂 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +9 | 煙火先于春 2026-03-17 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 0805材料320求調(diào)劑 +3 | 深海物語(yǔ) 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 22 350 本科985求調(diào)劑，求老登收留 +3 | 李軼男003 2026-03-20 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | Mqqqqqq 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 二本跨考鄭大材料306英一數(shù)二 +3 | z1z2z3879 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 22408 344分 求調(diào)劑 一志愿 華電計(jì)算機(jī)技術(shù) +4 | solanXXX 2026-03-20 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 南京大學(xué)化學(xué)376求調(diào)劑 +3 | hisfailed 2026-03-19 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 司空. 2026-03-18 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 317求調(diào)劑 +5 | 申子申申 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] A區(qū)線材料學(xué)調(diào)劑 +5 | 周周無(wú)極 2026-03-20 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 招收調(diào)劑碩士 +4 | lidianxing 2026-03-19 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料學(xué)碩318求調(diào)劑 +5 | February_Feb 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料工程專(zhuān)碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 6/300 |
|