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wpwrn銀蟲 (初入文壇)
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[求助]
融合PCR
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兩個(gè)片段進(jìn)行融合，一個(gè)不到200.一個(gè)2000多，怎么都容不上去？怎么辦？ 我的做法  CR產(chǎn)物各1ul,退火程序?yàn)椤 ?4℃ 5min變性，進(jìn)入PCR循環(huán)：94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min30s，10個(gè)循環(huán)，最后延伸72℃ 5min。然后加引物 實(shí)在是容不出來，求助，救命啊 |
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wpwrn3樓2013-05-28 22:57:57
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gyesang: 回帖置頂 2013-05-30 21:59:44
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你第一步產(chǎn)率怎么樣？ 另外我可以明確地說酶是問題，尤其是模板比較長(zhǎng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)比較多（包括高GC）的情況下，不同的酶差別不是一點(diǎn)。 “兩個(gè)片段PCR之后要純化嗎” 當(dāng)然要純化，如果有雜帶還要割膠 我做的時(shí)候開始就加引物的，沒遇到過任何問題。另外你設(shè)計(jì)引物時(shí)候自身的dimer和二級(jí)結(jié)構(gòu)傾向怎么樣，這個(gè)如果出現(xiàn)在融合區(qū)域，影響比較大。 |
23樓2013-05-30 21:15:12
克隆大蝦
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2樓2013-05-28 21:52:20
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好吧，我建議PCR使用 Phusion 或Q5（NEB）其極速，擴(kuò)增效率高，至于pfu我一般認(rèn)為超過2000的片段這個(gè)酶就有局限性了，擴(kuò)增效率比較低。如果一定要用這個(gè)傳統(tǒng)的PFU，可以試試touch-down。 實(shí)驗(yàn)要改革，使用最新的實(shí)驗(yàn)試劑！ |
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7樓2013-05-29 11:11:14
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9樓2013-05-29 13:26:05
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