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icanplay90銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
gateway體系連ENtry載體
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| 最近構(gòu)建gateway體系的入門載體，體系是pcr產(chǎn)物2ul，vector0.5ul,鹽溶液0.5ul。 之前用的時(shí)候，轉(zhuǎn)化一次，雖然長的點(diǎn)不多，但一般都有陽性克隆。這次想連一個(gè)啟動(dòng)子加基因全長的片段，大約6900bp左右。反應(yīng)的條件是22度30min。長了八個(gè)點(diǎn)，但是今天上午一鑒定，全是假陽性。。。這是為什么呀為什么？求指教問題出那了。。。 |
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6樓2013-06-05 22:08:36
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對 沒有菌落生長 感受態(tài)是實(shí)驗(yàn)室剛制備的。。。應(yīng)該沒問題 載體都是從公司里買的，產(chǎn)物是用phusion酶擴(kuò)的，gateway的位點(diǎn)應(yīng)該就是在上游引物5‘端加上CACC吧，抗性板是卡那抗性的，載體是卡那潮霉素雙抗的，板都是一起配的，別人卡那抗性的菌落可以生長，然后PCR產(chǎn)物，我濃縮以后跑過電泳，加了3ul，帶的亮度還可以，而且，我用PCR產(chǎn)物做模板擴(kuò)過該片段中間的一條帶，也亮度很好。我還以pcr產(chǎn)物為模板，上游單引物擴(kuò)過一次，條件跟擴(kuò)基因的時(shí)候是相同的，產(chǎn)生了彌散的條帶，從1000左右到6800左右的大亮斑。 還有個(gè)問題，濃縮之后的濃度接近400ng/ul，用不用稀釋？如果片段濃度過高會(huì)不會(huì)影響反應(yīng)？ |
7樓2013-06-05 23:39:10
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10樓2013-06-06 03:43:20
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