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icanplay90銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
gateway體系連ENtry載體
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| 最近構(gòu)建gateway體系的入門載體，體系是pcr產(chǎn)物2ul，vector0.5ul,鹽溶液0.5ul。 之前用的時(shí)候，轉(zhuǎn)化一次，雖然長(zhǎng)的點(diǎn)不多，但一般都有陽(yáng)性克隆。這次想連一個(gè)啟動(dòng)子加基因全長(zhǎng)的片段，大約6900bp左右。反應(yīng)的條件是22度30min。長(zhǎng)了八個(gè)點(diǎn)，但是今天上午一鑒定，全是假陽(yáng)性。。。這是為什么呀為什么？求指教問(wèn)題出那了。。。 |
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icanplay90
銅蟲 (初入文壇)
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對(duì) 沒(méi)有菌落生長(zhǎng) 感受態(tài)是實(shí)驗(yàn)室剛制備的。。。應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題 載體都是從公司里買的，產(chǎn)物是用phusion酶擴(kuò)的，gateway的位點(diǎn)應(yīng)該就是在上游引物5‘端加上CACC吧，抗性板是卡那抗性的，載體是卡那潮霉素雙抗的，板都是一起配的，別人卡那抗性的菌落可以生長(zhǎng)，然后PCR產(chǎn)物，我濃縮以后跑過(guò)電泳，加了3ul，帶的亮度還可以，而且，我用PCR產(chǎn)物做模板擴(kuò)過(guò)該片段中間的一條帶，也亮度很好。我還以pcr產(chǎn)物為模板，上游單引物擴(kuò)過(guò)一次，條件跟擴(kuò)基因的時(shí)候是相同的，產(chǎn)生了彌散的條帶，從1000左右到6800左右的大亮斑。 還有個(gè)問(wèn)題，濃縮之后的濃度接近400ng/ul，用不用稀釋？如果片段濃度過(guò)高會(huì)不會(huì)影響反應(yīng)？ |
7樓2013-06-05 23:39:10
starseacow
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2樓2013-05-31 18:57:21
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3樓2013-05-31 20:41:09
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4樓2013-05-31 20:57:31
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