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499649610金蟲 (小有名氣)
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[求助]
基因敲除 已有1人參與
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| 最近做細(xì)菌（革蘭氏陰性菌）的基因敲除，利用同源重組的方式（雙交換），請(qǐng)問(wèn)我設(shè)計(jì)左右同源臂至少應(yīng)該多長(zhǎng)，左右同源臂是一樣長(zhǎng)好還是不一樣長(zhǎng)好？求指導(dǎo)！我有設(shè)計(jì)一邊500多，一邊260的樣子，是否可行？求指導(dǎo)!還有，做敲除的注意事項(xiàng)能否告知�。ㄎ矣玫馁|(zhì)粒是自殺性質(zhì)粒，不引入抗性基因） |
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海驕子
銀蟲 (初入文壇)
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3樓2013-06-06 14:53:16
志子
至尊木蟲 (文壇精英)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+5, MicEPI+1, good，回答的很全面 2013-06-07 09:18:59
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+5, MicEPI+1, good，回答的很全面 2013-06-07 09:18:59
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非特異性回答，具體情況具體分析，僅供參考。 利用同源重組構(gòu)建基因敲除的基本步驟： a． 基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體�；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ�，所以一般設(shè)計(jì)為替換型載體。 b．ES 細(xì)胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。常用的鼠的種系是１２９及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。 ｃ．同源重組：將重組載體通過(guò)一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(ES cell)中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。 ｄ．選擇篩選已擊中的細(xì)胞：由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10－2～10-5，植物的概率為10－4～10－5。因此如何從眾多細(xì)胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選法（PNS法），標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及PCR法。其中應(yīng)用最多的是PNS法。 ｅ．表型研究：通過(guò)觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對(duì)小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。 f．得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對(duì)染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳. |
2樓2013-06-05 10:31:12
499649610
金蟲 (小有名氣)
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4樓2013-06-06 23:10:07
5樓2013-06-07 10:21:34
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